JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

ייצור של מיקרו-חלקיקים פולימריים פולסטיליים העוטפים אנטיגן כלבת

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65147
, , , , , , ,
1Department of Bioengineering,Rice University, 2Particles for Humanity, 3IMPACT Technology Development, 4Department of Chemistry,Rice University

Summary

שיטה זו מתארת את האנקפסולציה של אנטיגן הכלבת למיקרו-חלקיקים פולימריים מתכלים בעלי תכונות מבניות וחומריות המאפשרות שחרור פולסטילי לאחר עיכוב קבוע מראש. הערכת ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) של האנטיגן שנלקח מליבת החלקיק מאשרת את נוכחותו של גליקופרוטאין תקין של נגיף הכלבת הטרימרי באמצעות ייצור חלקיקים.

Abstract

ההנחיות הנוכחיות לטיפול מונע בכלבת לאחר חשיפה מחייבות מתן זריקות מרובות במשך מספר שבועות. זה יכול להיות מעיק באופן לא פרופורציונלי על אלה החיים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית (LMICs), שם מתרחשות רוב החשיפות הקטלניות לכלבת. אסטרטגיות שונות למתן תרופות נחקרו כדי לעבות משטרי חיסון לזריקה אחת על ידי עטיפת אנטיגנים לחלקיקים פולימריים. עם זאת, גורמי לחץ קשים במהלך תהליך האנקפסולציה עלולים לגרום לדנטורציה של האנטיגן העטוף. מאמר זה מתאר שיטה לעטוף את האנטיגן של נגיף הכלבת (RABV) במיקרו-חלקיקים פולימריים המפגינים שחרור פולסטילי מתכוונן. שיטה זו, המכונה Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), מייצרת מיקרו-חלקיקים באמצעות ליתוגרפיה רכה ליצירת תבניות פולידימתילסילוקסאן הפוכות (PDMS) מתבנית אב רב-פוטונית המודפסת בתלת-ממד. יריעות פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) עוברות דחיסה לתוך תבניות PDMS כדי ליצור גלילים פתוחים המלאים ב-RABV מרוכז באמצעות רובוט ניפוק פיאזואלקטרי. מיקרו-מבנים אלה נאטמים לאחר מכן על ידי חימום החלק העליון של החלקיקים, מה שמאפשר לחומר לזרום וליצור מחסום פולימרי רציף ולא נקבובי. לאחר הייצור, בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) ספציפית לזיהוי גליקופרוטאין תקין של נגיף הכלבת הטרימרי משמשת כדי לאשר את ההתאוששות הגבוהה של אנטיגן אימונוגני מהמיקרו-חלקיקים.

Introduction

החיסון הוא כלי רפואי יעיל ביותר, לאחר שמנע יותר מ -37 מיליון מקרי מוות בין השנים 2000 ל -20191. למרות יעילות זו, מחלות הניתנות למניעה באמצעות חיסונים ממשיכות להוות סיכון משמעותי לבריאות העולמית, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית (LMICs) שבהן שיעורים גבוהים של חוסר חיסון ותת-חיסון תורמים ל-1.5 מיליון מקרי מוות הניתנים למניעה על ידי חיסון מדי שנה2. כלבת אינה יוצאת דופן בפערים אלה. למרות מעמדה כמחלה הקטלנית ביותר הידועה לאנושות, בהיותה קטלנית כמעט באופן אוניברסלי, הכלבת ניתנת לטיפול מלא ומסווגת כמחוסלת במדינות רבות בעלות הכנסה גבוהה. במקום זאת, נטל הכלבת נישא באופן לא פרופורציונלי על ידי אנשים החיים בחלקים של אסיה ואפריקה, שם למחלה יש תוצאות הרסניות על בני אדם ובעלי חיים 3,4.

החיסון הוא קריטי לניהול ההשפעה העולמית של כלבת5. עלות החיסון אוסרת על יישום נרחב של טיפול מונע לפני חשיפה (PrEP), בהתחשב בשכיחות הנמוכה הכוללת של המחלה. יתר על כן, ב- LMICs, התועלת של מניעה לאחר חשיפה (PEP) מוגבלת על ידי לחצים סוציו-אקונומיים על חולים המבקשים טיפול רפואי. גורמים לוגיסטיים, כגון מרחק נסיעה לנקודות גישה לשירותי בריאות, אובדן שכר בעת קבלת טיפול, עלות הטיפול, פגישות המפריעות לפעילות יומיומית ושכחה, גורמים לשיעורי היענות PEP נמוכים עד 60%6,7. שיעור שחיקת חולים גבוה זה מהווה הזדמנות לשכלול גישות לטיפול בפערים בחיסון נגד כלבת כדי להילחם במחלה.

מערכות חיסון בזריקה אחת (SI) השולטות בשחרור אנטיגנים נחקרו כדרכים להשיג חיסון מלא בזריקה אחת. ביטול הצורך בביקורים מרובים אצל ספק שירותי בריאות מקל על הנטל המונע מאנשים לחפש טיפול הולם. כדי להשיג חיסון SI, אנטיגן בדרך כלל עטוף בתוך מטריצה פולימרית מתכלה שלעתים קרובות לובשת צורה של מיקרו-חלקיקים הניתנים להזרקה. לאחר ההזרקה, הפולימר מתפרק ומשחרר את האנטיגן הבודד. עד כה, שתי אסטרטגיות שחרור ראשוניות ננקטו כדי להשיג חיסון SI. בגישה אחת, האנטיגן משתחרר ברציפות לאורך זמן ממושך. למרות שנועדה להגביר את האימונוגניות של זריקה בודדת, לא ברור אם גישה זו מספיקה כדי לעורר תגובה חיסונית מגנה מפני נגיף הכלבת (RABV) בבני אדם8. בשני, האנטיגן משתחרר לאחר עיכוב קבוע מראש כדי לחקות משטר חיסונים קונבנציונלי ומוכח. שיטות ייבוש בהתזה ושיטות ייצור מיקרו-חלקיקים מבוססות תחליב/אידוי ממסים מציגות את האסטרטגיה הקודמת, ושימשו לתמצת בהצלחה הן את מודל החיסון9 והן אנטיגנים יציבים ביותר, כגון רעלן טטנוס10. עם זאת, שיטות אנקפסולציה אלה כוללות גורמי סטרס, כולל חום, אינטראקציה עם ממסים וכוחות פיזיקליים, שיכולים לנטרל אנטיגנים11.

חלקיקים נוזליים ואטומים באופן אחיד לתרופות אנקפסולט (PULSED) היא שיטת ייצור שפותחה לאחרונה שניתן להשתמש בה כדי לתמצת ביולוגים במיקרו-חלקיקים מתכלים. מיקרו-תבניות משמשות ליצירת חלקיקים המלאים במטען נוזלי ומחוממים כדי לאפשר לפולימר לזרום מחדש ולעטוף באופן מלא את מחסן המטען המרכזי בתוך שכבה רציפה של הפולימר המתכלה. מיקרו-מבנה זה גורם לשחרור פולסטילי של המטען, לאחר משך זמן התלוי בקצב ההתפרקות של הקליפה הפולימרית12. כתב יד זה מדגים את האנקפסולציה של RABV בלתי פעיל בתוך מיקרו-חלקיקים המורכבים מחומצה פולי(לקטית-קו-גליקולית) (PLGA), פולימר מתכלה המשמש בפורמולציות רבות שאושרו על ידי ה-FDA13, תוך שימוש בשיטת הייצור PULSED כדי לתמצת אנטיגן RABV יציב כפי שהוערך על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA). על ידי שילוב חלקיקי PLGA עם משקל מולקולרי שונה ו / או קבוצות קצה, לגישה זו יש פוטנציאל לחקות את מסלול הזמן הנוכחי של חיסון כלבת לאחר זריקה אחת.

Protocol

1. יצירת תבנית מאסטר חלקיקים הערה: ניתן לבצע את תהליך ההדפסה בתלת-ממד עם כל מדפסת תלת-ממד ברזולוציה מרחבית מספקת; עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התהליך עבור מדפסת תלת-ממד מרובת פוטונים. תכנון מבנים מיקרו-חלקיקים באמצעות תוכנית תכנון בעזרת מחשב (CAD).הערה: מפרט התכנון הוא כדלקמן: 308 חלקיקים (קוטר = 400 מיקרומטר, גובה = 500 מיקרומטר, ועובי דופן = 100 מיקרומטר) מסודרים במערך של 22 על 14, עם מרווח של 600 מיקרומטר ביניהם. העיצוב מכיל גם כוכב בעל ארבע נקודות וכוכב בעל חמישה קודקודים כפידוקיאלים הנמצאים מחוץ למערך (איור משלים 1). יצא את העיצוב הסופי כקובץ STL (קובץ קידוד משלים 1) והעלה את הקובץ לתוכנה המסוגלת להגדיר את פרמטרי ההדפסה כמוצג להלן. לאחר מכן, שמור אותו כקובץ התואם למדפסת התלת-ממד (ראה טבלת חומרים).הערה: מרחק חיתוך = 5 מיקרומטר, מרחק בקיעה = 1 מיקרומטר, מתאר מעטפת = 50 מיקרומטר, ספירת פרוסות בסיס = 5 מיקרומטר, פיגומים = חלול, מצב סריקה = גלבו, ציר z = מיקרוסקופ כונן z, מהירות סריקה = 100,000, הספק = 100. טפלו מראש במצע הדפסת סיליקון (ראו טבלת חומרים) באמצעות תהליך ניקוי פלזמה (גז: O2; הספק: 200 וואט; טמפרטורה: 25°C; זרימה: 20; זמן: 5 דקות), ואז טבלו מיד את המצע בתמיסה של 30 מ”ל אתנול ו-60 מיקרוליטר של 3-(טרימתוקסיסיליל) פרופיל מתקרילט בצלחת פטרי מזכוכית. מכסים ברדיד אלומיניום ומניחים לדגור למשך הלילה.הערה: שלב זה מגביר את היצמדות ההדפסה למצע, דבר חשוב במהלך הפרדת PDMS (שלב 2.6). העלה את קובץ ההדפסה למדפסת תלת-ממד מרובת פוטונים, החל את שרף ההדפסה על המצע המטופל, טען את עדשת 10x (ראה טבלת חומרים) והדפס את המיקרו-מבנים. לאחר שתסיים, טבלו את ההדפסה בפרופילן גליקול מתיל אתר אצטט (ראו טבלת חומרים) למשך 45 דקות כדי להסיר התנגדות לאור שלא נחשפה, ולאחר מכן טבלו את ההדפסה באיזופרופיל אלכוהול למשך 5 דקות. לאחר ריפוי תבנית האב על ידי חשיפתה לאור UV ב 254 ננומטר למשך 120 דקות.הערה: אם זמין, ניתן להשתמש באור UV בטווח של 405 עד 365 ננומטר למשך ~20 דקות כדי לרפא את המבנים המודפסים. 2. יצירת עובש פולידימתילסילוקסאן (PDMS) טפל בפני השטח של תבנית האב המודפסת בתלת-ממד על ידי הנחתה בתא ואקום המכיל שקופית זכוכית עם 40 μL של טריכלורו (1H,1H,2H,2H,-perfluorooctyl) (ראה טבלת חומרים) סילאן שנוסף למשטח. משוך את הוואקום (לחץ יחסי: -20 אינץ ‘. כג) למשך שעה אחת.הערה: שלב זה מבטיח הפרדה קלה בעת הסרת תבניות (שלב 2.6). בזמן הטיפול במשטח תבנית האב, ערבבו היטב את הבסיס הפרה-פולימרי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) עם חומר הריפוי הפרה-פולימרי PDMS ביחס של 9:1 לפי מסה (לפחות 10 גרם חומר נדרש לכל תבנית מאסטר). לאחר ערבוב יסודי, להעביר את PDMS uncured לצינור צנטריפוגה 50 מ”ל צנטריפוגה צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלמת הטיפול במשטח, הניחו את תבנית האב בכלי רדיד אלומיניום ושפכו את ה-PDMS שלא נרפא על גבי התבנית, כדי להבטיח שהתכונות שקועות לחלוטין. מניחים את צלחת רדיד האלומיניום בתא ואקום ומושכים את השואב (לחץ יחסי: -20 אינץ’. Hg) למשך שעה אחת כדי להסיר בועות אוויר. מוציאים את צלחת רדיד האלומיניום מתא הוואקום. הניחו ספייסרים בגודל 800 מיקרומטר בקצות תבנית המאסטר והניחו מגלשת זכוכית נקייה על תבנית המאסטר, תוך הקפדה להימנע מהחדרת בועות אוויר. השתמשו בתפסי קלסרים כדי להדק את התבנית ואת המגלשה יחד, ולמקם את כוח ההידוק מעל הספייסרים (איור משלים 2). הכניסו את המבנה לתנור לטמפרטורה של 120°C למשך 4 שעות לפחות כדי לרפא את הפרה-פולימר לתבניות PDMS. מוציאים את המבנה מהתנור, משחררים בזהירות את הקלסרים ומפרידים בזהירות את תבנית האב מתבנית PDMS שנרפאה באמצעות סכין גילוח.הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתבנית האב המודפסת בתלת-ממד כדי ליצור תבניות PDMS נוספות. 3. ייצור סרטי PLGA שקלו 450 מ”ג PLGA (ראו טבלת חומרים) והניחו אותו על יריעת פולימר נון-סטיק בגודל 76 מ”מ על 76 מ”מ בתוך טבעת בעובי 250 מיקרומטר, בקוטר פנימי של 50.8 מ”מ. הניחו יריעת פולימר נון סטיק שנייה מעל ה-PLGA ודחסו את הערימה בין שני בלוקי אלומיניום באמצעות מהדק C בקוטר 101.6 מ”מ עד לחוזק האצבע.הערה: 502H PLGA שימש אך ורק במחקר זה; עם זאת, סוגים אחרים של PLGA תואמים לתהליך זה. הניחו את המכלול המהודק C בתנור ואקום המכוון ל-120°C למשך 30 דקות תחת ואקום, בלחץ יחסי של -30 in.Hg. לאחר מכן, הסר את המכלול והדק היטב את המהדק לפני שתחזיר אותו לתנור הוואקום למשך 30 דקות נוספות.הערה: המטרה העיקרית של שימוש בוואקום היא למנוע התפרקות PLGA, המואצת בטמפרטורות גבוהות. מוציאים את המכלול מהתנור ומניחים לו להתקרר 4 שעות במייבש. לאחר שהתקרר, שחררו את המהדק, הסירו את סרט ה-PLGA מיריעות הפולימר הנון-סטיק והניחו את הסרט בצלחת פטרי מסומנת. אחסנו את צלחת הפטרי בתוך מייבש לשימוש מאוחר יותר. 4. יצירת חלקיקי PLGA טפל בפני השטח של תבנית PDMS כפי שתואר קודם לכן בשלב 2.1. בעזרת פינצטה ו/או אזמל, גזרו והניחו חלק מסרט PLGA בגודל 250 מיקרומטר, בערך בגודל המערך, על תבנית PDMS המטופלת. שכבו מיקרוסקופ זכוכית נקי, החליקו על גבי סרט PLGA ותבנית PDMS והדקו את הרכיבים זה לזה על ידי הנחת מהדק קפיץ ישירות מעל המערך וסרט PLGA. מניחים את מכלול העובש המהודק בתנור הוואקום המכוון ל -120 מעלות צלזיוס, ומושכים את השואב בלחץ יחסי של -30 אינץ ‘. כספית למשך שעה אחת.הערה: הזמן הדרוש ליצירת החלקיקים תלוי ב- PLGA, ויכול לנוע בין 1-12 שעות. מוציאים את מכלול התבנית המהודק מהתנור ומניחים לו להתקרר באופן פסיבי בטמפרטורת החדר כ-15 דקות, או עד שהוא מתקרר למגע. באמצעות סכין גילוח, הפעילו בעדינות לחץ בין תבנית PDMS לבין מערך חלקיקי PLGA כדי להפריד בין השניים. אחסנו את חלקיקי ה-PLGA במייבש לשימוש עתידי. 5. ריכוז וטיהור אנטיגן הפשירו אליציטוט אחד של אנטיגן RABV זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר. הרכיבו את מערך הסינון על ידי הצבת שני מסנני ספין צנטריפוגליים עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa (MWCO; ראו טבלת חומרים) בשני צינורות איסוף. הרטיבו מראש את שני מסנני הסחרור הצנטריפוגליים על ידי הוספת 500 μL של מים UltraPure. סובבו את המסננים במהירות של 2,400 x גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה על ספסל בטמפרטורת החדר. הסר את המים מהתאים העליונים והתחתונים של מערך הסינון באמצעות פיפטה של 200 μL.הערה: אין לאפשר למסנן הסחיטה המורטב מראש להתייבש. הוסף 400 μL של מים מזוקקים לתא העליון של כל מסנן סחיטה, ולאחר מכן הוסף 100 μL של אנטיגן RABV מופשר וערבב עם פיפטה.הערה: מחקר זה ריכז את האנטיגן בערך פי חמישה והפחית את ריכוז החומרים הפעילים <100 kDa פי ~ 50. טען את שני מסנני הספין הצנטריפוגליים לתוך צנטריפוגת ספסל, וודא שהמסננים פונים למרכז הצנטריפוגה. סמן איזה צד של המסנן פונה לכיוון מרכז הצנטריפוגה.הערה: אם הפתרונות מכוונים בצורה שגויה, הם לא יסוננו / ירוכזו כראוי. צנטריפוגה את המסננים ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אחזר את המסננים מהצנטריפוגה. צינורות האיסוף יכילו את התסנין, ואילו המסננים יכילו את הדגימה המרוכזת (איור משלים 3A). מוציאים את התסנין בצינורות האיסוף באמצעות פיפטה ומשליכים. הוסיפו 450 מיקרוליטר מים מזוקקים מסוננים לכל מסנן, וערבבו את הדגימה המרוכזת והמים על ידי צנרת למעלה ולמטה שש פעמים. צנטריפוגה שני מסנני הסחרור פעם שנייה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ודא שהמסננים פונים למרכז הצנטריפוגה באותו כיוון כמו בשלב 5.7. שלפו את יחידות הסינון מהצנטריפוגה, ובדיוק כמו קודם, הסירו והשליכו את התסנין מכל צינור באמצעות פיפטה. הסירו את מסנני הסחיטה מצינורות האיסוף וסגרו את מעטפות המסננים באמצעות החלק העליון של צינורות האיסוף (איור משלים 3B). הניחו את החלק התחתון של מעטפת מסנן הספין ישירות על מערבולת ומערבולת במהירות של 3,000 סל”ד למשך 30 שניות תוך החזקת מעטפת המסנן זקופה ובזוויות של 45° (איור משלים 3C).הערה: שלב זה נועד להשעות מחדש כל אנטיגן RABV שיצר גלולה במהלך תהליך הצנטריפוגה. הסר בזהירות את מכסה צינורות האיסוף ממארזי מסנן הסיבוב. החזירו את תרמילי המסנן לצינורות האיסוף שסופקו והפעילו סיבוב מהיר (2-3 שניות) כדי לאסוף כל נפח שאולי נלכד בפקק.הערה: סיבוב מהיר זה חייב להתבצע במיקרו-צנטריפוגה על ספסל. המסננים צריכים להיות משיקים לצנטריפוגה, בניגוד לתצורה הקודמת, כדי להבטיח שאף פתרון לא יאבד דרך המסננים. הפוך כל יחידת מסנן ספין לצינור איסוף חדש המסופק עם ערכת מסנן הסחיטה (ראה טבלת חומרים), וצנטריפוגה למשך 2 דקות במהירות של 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הדגימות המרוכזות. אחדו את הדגימות המרוכזות משני צינורות האיסוף לשפופרת איסוף אחת. מדוד והקלט את עוצמת הקול המתקבלת.הערה: המדגם המתקבל יהיה בעל ריכוז אנטיגן התחלתי גבוה פי 5 מהמלאי, יהיה בעל ריכוז מעורר קטן (<100 kDa) נמוך בערך פי 50 מהמלאי, וייראה מעט לבן חלבי. הנפח הכולל צריך להיות כ 44-48 μL. יש לאחסן את האנטיגן המרוכז פי 5 שנשטף פעמיים בטמפרטורה של 4°C עד למועד הניפוק, אך למשך לא יותר מ-16 שעות. לפני מילוי חלקיקים בתמיסה זו, צנטריפוגו את הצינור במהירות של 1,000 x גרם למשך דקה אחת כדי להסיר בועות. ניתן לדלל את התמיסה באמצעות מים מזוקקים כדי להגיע לריכוז היעד הנומינלי לניפוק. 6. מילוי חלקיקים מסנן ואקום 500 מ”ל של מים שעברו דה-יוניזציה דרך מסנן ואקום של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן מנטרל את התמיסה על ידי הפעלת ואקום (לחץ יחסי: -20 אינץ ‘. Hg) בזמן סוניקציה במשך 20 דקות. במהלך תקופה זו, חבר את נימי חלוקת הפיזו (PDC; ראה טבלת חומרים) למתקן הפיזואלקטרי. מקדמים את המכונה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים), ומניחים את השקופית עם חלקיקי PLGA באזור הניפוק. הגדר את “מצא נקודות ייחוס ליעד”, הפעל ולאחר מכן הגדר את “מצע היעד”, לפי תרשים משלים 4. טען 25 μL של האנטיגן המרוכז לתוך צלחת המקור ולטעון אותו לתוך המכונה. באמצעות PDCs, שאפו 10 μL של אנטיגן מרוכז לתוך קצה הניפוק, שטפו את החלק החיצוני של הקצה, ואז כיילו את יישור הניפוק (איור משלים 5). הזן “פרמטרים של הגדרת יעד” ולחץ על הפעלה (איור משלים 6). לאחר השלמתם, הסר את החלקיקים המלאים וודא שהם מלאים תחת סטריאוסקופ. עבור ישירות לשלב הבא בפרוטוקול. 7. איטום וקצירת חלקיקים הניחו בלוק מפלדת אל-חלד (ראו טבלת חומרים) על פלטה חשמלית. הניחו שתי שקופיות מיקרוסקופ על גוש הנירוסטה כך שיהיו מקבילות. ודא שבלוק הנירוסטה ישר, ולאחר מכן הפעל את הפלטה החמה וקבע את הטמפרטורה כך שטמפרטורת פני השטח של הנירוסטה תהיה 200 ° C. יש לוודא את טמפרטורת הפלטה החמה לפני האיטום. השהה את חלקיקי ה- PLGA המלאים מעל הפלטה החמה על ידי הנחתם על שתי שקופיות הזכוכית, ולאחר מכן הפעל מיד טיימר למשך 18 שניות.הערה: משך הזמן וחלקיקי החום הדרושים לאיטום ישתנו בהתאם לתכונות הכימיות של ה-PLGA המשמש לייצור החלקיקים. ניתן להשתמש במחזיק שקופיות מותאם אישית המודפס בתלת-ממד כדי לטפל בשקופיות במרחק בטוח מהפלטה החשמלית. קובץ STL מסופק כקובץ קידוד משלים 2. לאחר האטם, הסר את מערך החלקיקים מהפלטה החמה ותלה אותו מעל ספסל המעבדה על ידי הנחת מערך החלקיקים על שתי שקופיות זכוכית נפרדות. תנו לחלקיקים להתקרר למשך דקה. לאחר הקירור, ניתן לקצור את החלקיקים באמצעות אזמל תוך התבוננות דרך סטריאוסקופ. החזק את האזמל עם הלהב בזווית של 45° למגלשה והפעל לחץ על בסיס החלקיק כדי להפריד אותו ממגלשת הזכוכית. לאחר הקציר, השתמש באזמל כדי להעביר את החלקיקים לתוך 0.5 מ”ל צינורות קישור חלבון נמוך (ראה טבלה של חומרים). לאחר מכן, מלא את הצינורות עם 250 μL של תמיסת חיץ פוספט 1x (PBS) המכילה 30 מ”ג / מ”ל אלבומין בסרום בקר (BSA) ו 1 מ”ג / מ”ל גלוקוז.הערה: תמיסת הגלוקוז 30 מ”ג/מ”ל BSA ו-1 מ”ג/מ”ל שהוכנה ב-PBS תשמור על יציבות האנטיגן RABV. מעכו את החלקיקים תחת סטריאוסקופ באמצעות זוג פינצטות עדינות. ודא שאנטיגן RABV בליבת החלקיק זמין להמסה בתמיסה שמסביב. אחסנו את הדגימות במקרר בטמפרטורה של 4°C עד שניתן יהיה להעריך את עוצמת האנטיגן באמצעות ELISA. דגימות חייב להיות מופעל על ELSIA בתוך 7 ימים של הכנה. 8. הערכת האנטיגן על ידי ELISA אזהרה: אין לתת לצלחות המיקרו להתייבש בשום שלב. ערמו תמיד צלחות, ותמיד כסו את הצלחת העליונה באטם פלסטיק, צלחת ריקה או מכסה כדי למנוע התייבשות. הכינו את המאגרים בהתאם להוראות בקובץ משלים 1. הכינו 5 מ”ל של תמיסת ציפוי (חיץ קרבונט-ביקרבונט, pH 9.6) בריכוז של 2.5 מיקרוגרם/מ”ל על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של נוגדן הציפוי ל-4975 מיקרוליטר של חיץ הציפוי ב-pH 9.4-9.6.הערה: 5 מ”ל נדרש כדי לצפות 96 בארות עם 50 μL כל אחד (עם נפח נוסף עבור אובדן pipetting). הגדל את הנפח הכולל ב- 5 מ”ל עבור כל צלחת ELISA נוספת הדרושה. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לפלוט 50 μL של תמיסת הציפוי לתוך כל באר של microplate. הפתרון חייב לשמש לציפוי מיד לאחר הכנתו. טפחו בעדינות לאורך קצוות הצלחת על כף יד בכפפה כדי להבטיח שתחתית כל באר מכוסה באופן שווה בנוזל. אטמו את הצלחת בסרט הדבקה והניחו אותה על 37°C למשך שעה אחת, ולאחר מכן העבירו ל-4°C למשך הלילה. שלפו את הצלחות מאחסון קר ושטפו אותן שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של חיץ כביסה בכל באר. הסירו את חיץ השטיפה והכניסו 300 מיקרוליטר של חיץ חוסם לכל באר.זהירות: כאשר מריצים מספר צלחות עם אותן דוגמאות החוזרות על עצמן על לוחות שונים, חשוב להמשיך צלחת אחר צלחת (כלומר, למלא את צלחת 1 בחומר לפני שממשיכים לצלחת 2, ולאחר מכן לצלחת 3 וכן הלאה). אין למרוח חומר X על כל הלוחות ולאחר מכן על חומר Y וכו’, מכיוון שהדבר יגדיל את הסיכון להתייבשות בארות. לאחר שלב השטיפה הסופי, חיץ השטיפה צריך להישאר בבארות הצלחת ולהשליך אותו רק מיד לפני הוספת דוגמאות לצלחת. יש להשתמש במכסה צלחת פלסטיק של 96 בארות כדי לכסות את כל הבארות של צלחת ELISA שאינן מועברות מיד, והמכסה זז ברצף כדי לחשוף בארות נוספות שיש למלא בחומר. אטמו את הצלחות בסרט פלסטיק דביק (ראו טבלת חומרים) והניחו אותן באינקובטור למשך 60 ± 5 דקות בטמפרטורה של 37 ± 2 מעלות צלזיוס. הכן את העקומה הסטנדרטית ובדוק דגימות להערכה במהלך דגירה זו.הערה: האנטיגן הנבדק חייב להיות מדולל מראש במאגר מדלל בדילול מומלץ של 0.125 IU/mL, עם נפח עודף של לפחות 40 μL כדי להסביר אובדן צנרת. כל הדגימות מוערכות בכפילות (שני עותקים טכניים) על כל צלחת ELISA. עבור העקומה הסטנדרטית, יש לכלול סדרת דילול כפולה עבור סך של שמונה נקודות בעמודות 2 ו -3 של כל לוח ELISA. ניתן לבצע סדרת דילול עבור כל הדגימות האחרות עם מספר מתאים של נקודות בהתבסס על כמות האנטיגן הצפויה המוערכת. למרות שהוא פחות קפדני עבור תפוקה גבוהה יותר, דילול מדגם יחיד יכול לשמש כחלופה לציפוי שתואר לעיל. עם זאת, הריכוז הצפוי של דילול יחיד חייב להיות בטווח העקומה הסטנדרטית. בצלחות חלבון 96 בארות בעלות קישור נמוך, או בצינוריות חלבון בעלות קישור נמוך (ראו טבלת חומרים), בצעו סדרת דילול כפולה של כל דגימה לאורך עמודי הצלחת. טען את תחילת סדרת הדילול בשורה A עבור כל דגימה בהתאמה בנפח כפול מהנפח הסופי הנדרש (לכל צלחת נדרשים 100 מיקרוליטר דגימה לכל באר, כך שכל הבארות ב- A2-A11 צריכות להכיל לפחות 240 μL של דגימה, עם נפח נוסף של 40 μL כדי להסביר את אובדן הצנרת). יש להעמיס 120 μL של חיץ מדלל לכל הבארות האחרות בלוח החלבון בעל הקישור הנמוך, למעט עמודות 1 ו-12 (כלומר, B2 עד H11). באמצעות פיפטה רב ערוצית עמוסה ב-10 קצוות, בצעו דילול סדרתי על ידי העברת דגימה של 120 מיקרוליטר מ-A2-A11 ל-B2-B11 ופיפטוף מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב תוך הימנעות מהתזת ובועות. חזור על תהליך זה, נע במורד הצלחת לאורך העמודים עד בארות H2-H11. השליכו את הנפח הנותר של 120 μL שנלקח מהשורה האחרונה של הבארות.הערה: הדגימות מוכנות כעת לניתוח. אם שלב החסימה לא הושלם בשלב זה, ודא שהדגימות נשמרות על קרח. בסוף שלב הדגירה, לשטוף את הצלחות שלוש פעמים עם 200 μL של חיץ שטיפה. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 100 μL של חיץ מדלל לתוך עמודות 1 ו 12 כמו “החסר”. באמצעות פיפטה רב ערוצית, מעבירים 100 μL מכל באר של צלחת 96 בארות חלבון בעלת קישור נמוך המכילה דילול דגימה לצלחת ELISA השטופה. חזור על הפעולה עבור כל צלחות ELISA המופעלות. אוטמים את הצלחות עם סרט פלסטיק דביק ומניחים אותם באינקובטור למשך 60 ± 5 דקות ב 37 ± 2 מעלות צלזיוס. הכינו את תמיסת הנוגדנים לגילוי (ראו טבלת חומרים) בריכוז של 0.2 מיקרוגרם/מ”ל על ידי הוספת 4.4 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים ל-10,995.6 מיקרוליטר של החיץ המדלל וערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.הערה: סך של 11 מ”ל נדרש עבור 96 בארות ב 100 μL כל אחד (עם נפח נוסף עבור הפסדי צנרת). הגדל את הנפח הכולל ב- 11 מ”ל עבור כל צלחת ELISA נוספת המוערכת. יש להשתמש בתמיסה מיד לאחר ההכנה. בסוף שלב הדגירה, לשטוף את הצלחות חמש פעמים עם 200 μL של חיץ שטיפה. שאפו את חיץ השטיפה הנותר ושחררו 100 μL של תמיסת נוגדני הזיהוי לכל באר על צלחת המיקרו באמצעות פיפטה רב ערוצית. אוטמים את הצלחות עם סרט פלסטיק דביק ומניחים אותם באינקובטור למשך 60 ± 5 דקות ב 37 ± 2 מעלות צלזיוס. הכינו את המצומד לקראת סוף שלב הדגירה של נוגדני הזיהוי על ידי הוספת 4.4 μL של תמיסת סטרפטווידין-פרוקסידאז מצומדת (ראו טבלת חומרים) ל-10,995.6 מיקרוליטר של חיץ שטיפה.הערה: סך של 11 מ”ל נדרש עבור 96 בארות ב 100 μL כל אחד (עם נפח נוסף עבור צנרת רב ערוצית). הגדל את הנפח הכולל ב- 11 מ”ל עבור כל צלחת ELISA נוספת המוערכת. שטפו את הצלחות חמש פעמים עם 200 מיקרוליטר של חיץ כביסה. שאפו את חיץ הכביסה הנותר והפיצו 100 מיקרוליטר של התמיסה המצומדת לכל באר. אטמו את הצלחות בסרט פלסטיק דביק והניחו אותן באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 ± 5 דקות ב 37 ± 2 מעלות צלזיוס. הכינו את המצע בשלב השטיפה הסופי בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). עבור כל צלחת, יש להמיס טבליה אחת של o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD; ראו טבלת חומרים) ב-9 מ”ל של מים שעברו דה-יוניזציה בחושך, ולאחר מכן למלא ב-1 מ”ל של חיץ חמצן יציב פי 10. התאם את מספר הטבליות ואת נפח התמיסה הכולל (10 מ”ל) בהתאם למספר הצלחות המוערך. שטפו את הצלחות חמש פעמים עם 200 מיקרוליטר של חיץ כביסה. יש לחלק 100 מיקרוליטר של המצע לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. אטמו את הצלחות בסרט פלסטיק דביק והשאירו אותן על הספסל למשך 10-20 דקות, מוגנות מפני אור, באמצעות רדיד אלומיניום.הערה: נטר את התפתחות הצבע באופן חזותי כדי למנוע רוויה. הוסף 50 μL של תמיסת עצירה לכל באר ואת לוח הקריאה מיד לספיגה ב 492 ננומטר וספיגת ייחוס של 620 ננומטר. נתח את הנתונים באמצעות קריאת הקליטה המתוקנת (קריאה ב- 492 ננומטר פחות הקריאה ב- 620 ננומטר) והפחת את הממוצע של החסר מכל הדגימות. השתמש בשיטת אינטרפולציה סיגמואידית 4PL כדי להמיר ערכי ספיגה ל- IU/mL. לבסוף, הכפל ב- 250 μL (נפח הדגימה הכולל) כדי להמיר ל- IU.הערה: ניתוח זה יכול להיעשות באמצעות תוכנה לניתוח נתונים.

Representative Results

איטום ומילוי חלקיקים הם שניים מהשלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה. חלקיקים מולאו במלח נתרן פלואורסצאין כדי להדגים מילוי אידיאלי וכמה שגיאות נפוצות. מלח נתרן פלואורסצאין שימש במקום האנטיגן RABV כדי להקל על הדמיה. במהלך המילוי, חשוב לפזר תמיסה לתחתית ליבות החלקיקים, ואז לאפשר מספיק זמן לממס/מים להתאדות. לאחר השלמתו, מחסן של המומס נשאר בתחתית ליבת החלקיקים (איור 1A). לאחר המילוי, קריטי לאטום את החלקיקים כראוי. איור 1B מדגים כמה תוצאות (מוצלחות ולא מוצלחות) של תהליך האיטום. לאחר 12 שניות של זמן איטום, נשאר מסלול ברור ממרכז החלקיק אל מחוץ לחלקיק, מה שמדגים חלקיק שאינו אטום לחלוטין. לעומת זאת, אם משאירים אותו לאטום במשך 36 שניות, ה-PLGA נמס כמעט לחלוטין, והתוצאה היא מיקרו-מבנה עם פרופיל רדוד. ניתן להמחיש את המורפולוגיה האידיאלית כאשר חלקיקים אטומים למשך 18 ו -24 שניות, מכיוון שהם מכילים מטען עטוף כולו על ידי הפולימר תוך שמירה על מבנה חלקיקים. איור 1C מדגים כמה תוצאות אפשריות לאחר מילוי ואיטום. במהלך הניפוק, אם הממס אינו מגיע לתחתית החלקיק, הוא משאיר מומס יבש באמצע ליבת החלקיק (מלא באופן שגוי); למרות שחלקיקים אלה עדיין עשויים להיאטם, העמסה לקויה של מטען עלולה להגביל את יעילות ההעמסה. אם חלקיקים מלאים ביותר מדי מטען (מלאים יתר על המידה), תהליך האיטום מעוכב, מכיוון שהמטען מונע מ- PLGA לזרום מעל הפתח. כאשר הם מלאים ואטומים כראוי, חלקיקים בגיאומטריה זו קטנים מספיק כדי להיכנס בקלות לתוך מחט של 19 גרם. יתר על כן, 10 חלקיקים זרמו באופן עקבי דרך מחט של 19 גרם (100% ± 0%) כאשר הוזרקה להם תמיסה צמיגה כגון 2% קרבוקסימתיל צלולוז (איור משלים 7). איור 1: בעיות נפוצות בתהליך המילוי והאיטום . (A) תמונות מראות אידוי של ממס לאחר מחזור מילוי אחד, שבו חלקיקים נטענים עם 6 nL של 100 מ”ג / מ”ל מלח נתרן פלואורסצאין מומס במים. (B) תמונות מייצגות של חלקיקי 502H PLGA שהוסרו מתהליך האיטום ב-0, 12, 18, 24 ו-36 שניות. (C) תוצאות שונות של תהליך האיטום כאשר חלקיקים מולאו כראוי, באופן שגוי או במילוי יתר. תמונות נוצרות על-ידי מיקוד, הערמת תמונות מרובות ומיזוג שלהן באמצעות תוכנת ערימת מיקוד. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. עיבוד האנטיגן דרך מסנן ספין לפני טעינתו לחלקיקים חשוב משתי סיבות. ראשית, הצנטריפוגה משמשת לסילוק חומרי עזר מלאי בתמיסת החיסון, שיכולים להגביל את קיבולת טעינת החלקיקים תוך שמירה על האנטיגן RABV. הפרוטוקול הנוכחי מטהר את האנטיגן בערך פי 50. שנית, האנטיגן מרוכז גם בתהליך זה. איור 2A מראה מיקרוגרף של נגיפים שלמים מסוג RABV בדגימת האנטיגן המרוכזת. אנטיגן זה מרוכז בערך פי 4.4 מתמיסת המלאי ההתחלתי (איור 2B). ניתן לשנות את כמות האנטיגן שנטען בתחילה לתוך מסנני הספין הצנטריפוגליים כדי לווסת את ריכוז הקיפול הסופי שהושג. לדוגמה, העמסת 40 μL של אנטיגן מלאי גורמת לריכוז משוער של פי 1.75. איור משלים 8 מדגים את חשיבות המערבולות (שלב 5.15) בתהליך הריכוז. הזנחת מערבולות או ערבול לא נכון של הדגימות מגבילות את תהליך הריכוז. איור 2: ריכוז אנטיגן. ריכוז האנטיגן על ידי סינון צנטריפוגלי מוצג במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (A) ומאושר על ידי ELISA (B). קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות מבחני השוואה מרובים של Tukey עם ANOVA חד-כיוונית. **p < 0.01, ****p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3A מתאר אנטיגן מרוכז שמולא בחלקיקים לא אטומים ואטומים. למרות שכמות משמעותית של אנטיגן נטענת לתוך החלקיקים (0.0469 ± 0.0086 IU), חומר זה מהווה <90% מקיבולת החלקיקים, מה שמשאיר מקום רב לטעינה של אנטיגן נוסף. מעניין לציין כי חלקיקים לא אטומים מכילים רק 0.0396 ± 0.0077 IU, המהווים רק 85% ± 16% מהכמות הכוללת הטעונה. למרות אובדן חסר משמעות סטטיסטית, ייתכן שחלק מהאנטיגן RABV עבר דנטורציה במהלך התייבשות חוזרת ונשנית בתהליך המילוי. לאחר האיטום, 69% ±-5% מהאנטיגן נשארים עטופים בצורה ביו-אקטיבית. אף על פי שזה מצביע על אובדן משמעותי שמתרחש במהלך תהליך האיטום עקב לחץ תרמי, רוב האנטיגן הנגיפי המומת נשאר שלם (איור 3B). אנקפסולציה משותפת של חומרים פעילים מייצבים יחד עם האנטיגן היא אסטרטגיה אפשרית אחת להגברת יציבות האנטיגן לאורך כל תהליך הייצור, ובעבר הצליחה עם אנטיגנים אחרים של נגיף מומת14,15. איור 3: אנטיגן RABV ביו-אקטיבי לאחר ייצור חלקיקים . (A) תמונות מראות חלקיקים לא אטומים ולא אטומים המכילים את האנטיגן RABV. (B) יציבות אנטיגן בתהליך ייצור החלקיקים (n = 4). בקרת ההעמסה נוצרת על ידי ניפוק האנטיגן ישירות לתמיסה. קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות מבחני השוואה מרובים של Tukey עם ANOVA חד-כיוונית. *P < 0.05. תמונות נוצרות על-ידי מיקוד, הערמת תמונות מרובות ומיזוג שלהן באמצעות תוכנת ערימת מיקוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור משלים 1: ממדי חלקיקים, ממדים פידוקיים ומערכי מערך. האיור מציג את התכונות הגיאומטריות של הכוכב בעל ארבע הנקודות (A), המיקרו-חלקיק הגלילי (B), הכוכב בעל חמשת הקודקודים (C) ומערך של חלקיקים עם פידוקיאלים (D) המוצגים בתוכנת CAD. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור משלים 2: איור זה מראה חתך רוחב של המבנה שהוכנס לתנור כדי לרפא תבניות PDMS. חצים מציינים היכן מוחלים מהדקי קלסר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור משלים 3: טכניקה נכונה לשחזור יעיל של אנטיגן מרוכז. בסוף הספין הראשון, הדגימה המרוכזת המסומנת בעיגול אדום (A) נשמרת בפילטר, ואילו התסנין נאסף בתחתית צינור האיסוף (צינור חיצוני גדול יותר). כדי להשהות מחדש את האנטיגן הכדורי, יחידת המסנן הצנטריפוגלי סגורה באמצעות צינור האיסוף (B) כהכנה למערבולת. בעת מערבולת, קצה הצינור נשמר במגע עם כרית המערבולת וקצה המכסה מסתובב סביב תוך שמירה על זווית של 45° עם משטח המערבולת (C). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור משלים 4: מתקן פיאזואלקטרי לתכנות טרום הפעלה. (A) הגדר את “מצא נקודות התייחסות ליעד” על-ידי ניווט מהכרטיסייה “ראשית” להגדרת הרובוט > שונות >הפונקציה Div. > מצא נקודות התייחסות יעד. השתמש בלחצנים המסומנים בכחול כדי להגדיר את סימני הנאמנות. ראשית, בחר למד תבנית וצייר תיבה סביב סימן הנאמנות של עניין, ודא את דיוק התבנית על ידי לחיצה על תבנית חיפוש, ושמור את התבנית. בצע פעולה זו עבור כוכבים בעלי ארבע וחמש נקודות, ושמור את שמות הקבצים בהתאם להוראות תחת השתמש בשתי תמונות תבנית שונות. לאחר מכן, ודא שכל הפרמטרים בתיבות השחורות תואמים. טען את הכוכב בעל ארבעת הקודקודים באמצעות תבנית הטעינה (תיבה ירוקה). שמור את התוכנית “מצא נקודות התייחסות ליעד” על-ידי בחירת רשימת משימות (תיבה כתומה). (B) הגדר את ההפעלה על-ידי ניווט לכרטיסייה הגדרת רובוט > משימות, ולאחר מכן טען את רצף המשימות המוצג בתיבה הכחולה על-ידי הוספת משימות מרשימת המשימות (תיבה שחורה) באמצעות בחירות משימה בהפעלה (תיבה ירוקה). לבסוף, שמור את המשימה (תיבה כתומה). (C) הגדר את “מצע המטרה” על-ידי ניווט להגדרת הרובוט > מצע היעד, ולאחר מכן הוסף יעד (תיבה כחולה). (D) הזן את הפרמטרים המוצגים כאן ובחר שמור (תיבה כחולה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. תרשים משלים 5: טעינת אנטיגן וכיול יישור הוצאות. (A) נווט לכרטיסייה Nozzle Setup > Do Task ושאפו 10 μL של האנטיגן לתוך קצה החלוקה על ידי בחירת TakeProbe10 uL (קופסה שחורה) ולחיצה על DO (קופסה שחורה). (B) פעולה זו פותחת חלון נפרד. בחר את הבאר שאליה הועמס האנטיגן המרוכז ובחר אישור (תיבה כחולה). (C) לאחר שאיבת האנטיגן, שטפו את החוד על ידי בחירת הקופסה הכחולה, וחזרו על שטיפה זו פעמיים נוספות. בחר את המצלמה (קופסה שחורה) וקבע את עוצמת הקול של השחרור על-ידי בחירה באפשרות עוצמת קול (תיבה ירוקה). ודא שנוצרת ירידה יציבה עם סטיית תקן נפח (%) <2 (קופסה כתומה). (ד) ביצוע שלבים אלה יפתח את מצלמת ה-Snap Drop Cam; בחר תמונה (תיבה כחולה) בתפריט הנפתח ובחר אשף מצלמת ראש נחיר. פעולה זו פותחת חלון חדש. בצע את רצף השלבים הבא במהירות. (E) ודא שהיעד שנעשה באיור משלים 4 נטען, ולאחר מכן בחר העבר ליעד (תיבה כחולה). התאם את הטיפות ל- 15 ובחר ספוט (קופסה שחורה). לאחר הזיהוי, בחר מיד העבר (תיבה ירוקה). ודא שהאפשרות חיפוש אוטומטי נבחרה ומחק את גודל החלקיקים = 12, ולאחר מכן לחץ על התחל (תיבות כתומות). אם הזיהוי האוטומטי נכשל, חזור על תהליך זה לאחר מעבר לאזור אחר בשקופית (תיבה סגולה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. תרשים משלים 6: תכנות מערך איתור ותחילת הריצה. (A) נווט אל Target Setup > Target, ולאחר מכן מלא את הפרמטרים המוצגים בתיבה הכחולה. (B) לאחר מכן, נווט אל הכרטיסייה “הגדרת שדה” והזן 20 לתוך לא. שדה טיפות (תיבה כחולה), בחר באר (תיבה שחורה) ולאחר מכן בחר מטרות/חלקיקים לחלק (תיבה ירוקה). על ידי בחירת באר אחרת ובחירה מחדש של המטרות/חלקיקים, מתבצעים מחזורי מילוי נוספים במהלך ריצה אחת. (C) במסך הראשי, ודא שהריצה והיעד שנוצרו באיור משלים 5 נבחרו. (D) נווט אל “הכרטיסייה הפעלה” ובחר התחל הפעלה (תיבה כחולה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור משלים 7: הזרקת מיקרו-חלקיקים. (א-ג) תמונות סטריאוסקופיות ממוקדות של מיקרו-חלקיקים מלאים במלח נתרן פלואורסצאין ואטומים במחט של 19 גרם. (D) סך של 10 חלקיקים הוזרקו דרך מחט 19 גרם באמצעות תמיסת תאית קרבוקסימתיל 2% (n = 8). סרגל קנה מידה = 1 מ”מ. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. תרשים משלים 8: בעיות אפשריות בריכוז האנטיגן. הקו האדום מציין את העלייה הצפויה בריכוז. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות מבחני ההשוואה המרובים של Tukey עם ANOVA חד-כיוונית. p < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 1: הכנת מאגרים ופתרונות עבור RABV ELISA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ קידוד משלים 1: קובץ STL המכיל מערך חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ קידוד משלים 2: קובץ STL המכיל גיאומטריה עבור מחזיק השקופיות המותאם אישית המשמש לאיטום חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

ניתן לשנות את גיאומטריית החלקיקים לצרכים ספציפיים; עם זאת, עבור מבנים גליליים, המחברים ממליצים לשמור על יחס של 5:4:1 של גובה:קוטר:עובי דופן המתואר בפרוטוקול. יחס גובה-רוחב זה מבטיח נוכחות של מספיק חומר PLGA כדי לאטום את החלקיקים ולהישאר חזקים מספיק מבחינה מכנית לטיפול. ניתן לשנות בקלות את מידות וצורות החלקיקים במהלך תהליך CAD, מה שמאפשר ליצור מספר עצום של גיאומטריות. שילוב הגמישות של CAD עם הדפסה בתלת-ממד מאפשר איטרציה מהירה של עיצובי מיקרו-חלקיקים. למרות שפרוטוקול זה משתמש במדפסת תלת-ממד מרובת פוטונים, ניתן להשתמש בכל מדפסת תלת-ממד עם מפרט המסוגל להדפיס את מידות המיקרו-מבנה בחומר מתאים כדי ליצור את תבנית האב הראשונית. יתר על כן, פוטוליתוגרפיה שימשה בעבר ליצירת מבנים דומים במערכים גדולים בהרבה מאלה המיוצרים בפרוטוקול זה; עם זאת, העבודה, העיכוב בהזמנת מסכות פוטו בהתאמה אישית ונגישות הציוד יאטו את תהליך העיצוב האיטרטיבי16. לבסוף, ייצור עובש מאסטר יכול להיות במיקור חוץ לחברות תשלום עבור שירות אם ייצור עובש מאסטר בתוך הבית אינו ריאלי. ללא קשר למדפסת התלת-ממד או לשיטה המשמשת ליצירת תבניות האב, ההיצמדות של ההדפסה למצע היא קריטית לשלבים במורד הזרם. באופן ספציפי, אם ההדבקה אינה מספקת במהלך יצירת תבנית PDMS, חלקיקים מודפסים יישארו תקועים בתבנית PDMS, דבר הדורש הסרה ידנית של החלקיקים המודפסים והרס תבנית האב.

מילוי חלקיקים הוא היבט קריטי נוסף שיש לקחת בחשבון. למיקרו-חלקיקים יש יכולות מילוי מוגבלות, ולכן סינון משמש לא רק לריכוז האנטיגן RABV אלא גם להסרת חומרי עזר מלאי שאחרת היו תופסים חלק גדול מנפח ליבת המיקרו-חלקיקים. עם זאת, בהתחשב בגודל הגדול של אנטיגן RABV (כ 60 ננומטר על 180 ננומטר)17, ניתן לפלוט חלקית את האנטיגן במהלך שלבי הצנטריפוגה. מסיבה זו, חשוב להשעות מחדש את האנטיגן על ידי צנרת או מערבולת לאחר צנטריפוגה כדי להשיג התאוששות גבוהה של אנטיגן RABV. פתרון מרוכז מאוד הוא אידיאלי עבור ניפוק, כי זה מפחית את מחזורי ניפוק ובכך מגביל השפלה אנטיגן במהלך המילוי. עם זאת, צמיגות היא מגבלה עיקרית של רובוטים מחלקים פיאזואלקטריים היוצרים ירידה יציבה, ולכן ניפוק תמיסה בריכוז גבוה מאוד עשוי להיות בלתי אפשרי או מומלץ. דילול תמיסת המילוי היא הדרך הקלה ביותר להשיג היווצרות טיפה יציבה, אך יש לקחת בחשבון יציבות אנטיגן על פני מחזורי המילוי הנוספים הדרושים להשגת העומס הרצוי ומשך הזמן הארוך יותר הנדרש למילוי חלקיקים.

מגבלות
שיטה זו דורשת ציוד מיוחד מאוד לייצור התבניות הראשוניות וכלי מילוי מיוחד לייצור מיקרו-חלקיקים. למרות שניתן לחתור תחת הצורך במדפסת תלת-ממד עם רזולוציית הדפסה המסוגלת ליצור את תבניות האב הראשוניות באמצעות גישה של תשלום תמורת שירות, הנגישות לרובוט חלוקה פיאזואלקטרי מגבילה. רכישת רובוט ניפוק פיאזואלקטרי דורשת השקעה ראשונית משמעותית מראש, לרוב בטווח של 80,000 עד 200,000 דולר, תלוי במותג, בתפוקה וביכולות. למרות שמספר שיטות מילוי אחרות הן חלופות אפשריות, שיטות אלה לא אומתו באמצעות אנטיגן RABV12.

יישומים עתידיים
חלק ניכר מהאנטיגן RABV העטוף נשאר יציב בתהליך האיטום. בתיאוריה, על ידי שילוב אנטיגן זה בחלקיקים המורכבים מסוגים שונים של PLGA המחקים את ציר הזמן של מתן טיפול מונע לאחר החשיפה, כל המינונים יכולים להינתן בזריקה אחת. ביטול הצורך בביקורים חוזרים בבית החולים למתן מנות נוספות ישפר את היענות המטופלים, וכתוצאה מכך תוצאות טיפול טובות יותר. יתר על כן, לאחר שהוכיח את היכולת לשמור על תגובתיות ELISA של נגיף הכלבת המומת המורכב ביותר, סביר להניח כי אנטיגנים אחרים, כולל חיסונים תת-יחידתיים, יהיו תואמים לשיטת אנקפסולציה זו. שימוש באנטיגנים מניעתיים אחרים עם מיקרו-חלקיקים PULSED יכול להציל מיליוני חיים ב-LMICs על ידי הגדלת שיעורי ההתחסנות של אוכלוסיות לא מחוסנות. עם זאת, כדי להשיג זאת, חיסונים חייבים להישאר יציבים לא רק באמצעות אנקפסולציה אלא גם שחרור, מה שעשוי להיות מאתגר מכיוון שהמטען יהיה נתון לטמפרטורות גבוהות ולמיקרו-סביבה חומצית פוטנציאלית עקב חום הגוף ומוצרי פירוק PLGA18. עבודה עתידית תעסוק באסטרטגיות ייצוב של האנטיגן באמצעות שחרור, מה שיפתח את הפוטנציאל לפלטפורמת חיסון בזריקה אחת הישימה באופן נרחב למניעת מחלות זיהומיות רבות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לכירון ברינג ולבהראט ביוטק אינטרנשיונל על אספקת אנטיגן RABV ל-Particles for Humanity. ברצוננו גם להודות לצ’ארלס רופרכט, VMD, MS, PhD., על הדרכתו שלא תסולא בפז ותרומותיו הטכניות. המחברים רוצים להודות לנדיבותה של ד”ר רבקה ריצ’רדס-קורטום שאפשרה את השימוש במכשיר חלוקת הפיקולטר SciFLEXARRAYER S3 שלה ולהוראה של ד”ר צ’לסי סמית על השימוש במכשיר. אנו מודים גם לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ’וסטס צ’אן על יצירת תמונות מיקרוסקופיות של אנטיגן הכלבת. לבסוף, אנו מודים לדון צ’יקרינג וארין אוליאנו על סקירת המסמך לפני הגשתו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק (INV-004360) מקרן ביל ומלינדה גייטס.

Materials

0.22 µm PES filter Cole-Parmer+B4B2:B63 04396-26
0.25 mm Shims McMaster Carr 98090A935
0.75 inch Binder Clips Staples 480114
10 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11E
101.6 mm C-Clamp Amazon PT-SD-CP01A Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle EXCELINT 26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate  Millipore Sigma M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Eppendorf 22431081
50 mL Centrifuge Tubes Corning  352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11F
Acetone Fisher AC268310010
Aluminum Block McMaster Carr 9057K175
Aluminum Foil VWR 89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa Millipore Sigma C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 Fisherbrand 13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated Fisherbrand 14-388-100
Carboxymethyl Cellulose Tokyo Chemical Industries C0045
ClipTip 300, Filter, Racked Fisherbrand 13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3207
Describe Nanoscribe Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2.
Software provided with the printer.
Desiccator Fisher Scientific 10529901 Or equivalent
Double-Sided Tape Staples 649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium Gibco 14200075
Ethanol VWR 89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL Fisherbrand 13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL Fisherbrand 13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL Fisherbrand 03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL Fisherbrand FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL Fisherbrand 13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit Fisherbrand 05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller  Fisherbrand FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm VWR 470313-346
Glass Slides Globe Scientific 1380-10
Helicon Focus 8 HeliconSoft Software used to focus stack images
IP-Q Resin Nanoscribe Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple Amazon 5053485896236 Or equivalent
Microscope Slide Box Millipore Sigma Z374385-1EA Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective Nanoscribe
NanoWrite Nanoscribe Software used to interface with nanoscrive 3D printer.
Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate Invitrogen 44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) Fisherbrand 02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. Fisherbrand 13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating Scienion P-2020
PDMS Particle Molds Rice University n/a N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) Fisherbrand 02-707-430
Plastic Cups Fisher Scientific S04170
PLGA Film, 502H Sigma 502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate Millipore Sigma 484431
Rabies Antigen Chiron Behring and Bharat Biotech International Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades VWR 55411-050
Scalpel VWR 21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 Scienion Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates Thermo Scientific 15036
Silicon Wafer University Wafer 1025
Spring Clamps IRWIN VGP58100
Stainless Steel Block McMaster Carr 9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive Fisherbrand 02-707-404
Sylgard 184 DOW 2646340
Teflon Sheet McMaster Carr 9266K12 Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick McMaster Carr 9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane Sigma 448931-10G
Tweezers  Pixnor ESD-16
UltraPure Distilled Water Fisher Scientific 10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker UVP 95-0174-01 Or equivalent
Vacuum Desiccator Bel-Art F420100000 Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C VWR 97027-664 Or equivalent
Vacuum, CRVpro4  Welch 3041-01 Or equivalent
Wooden Tongue Depressors Electron Microscopy Sciences 72320
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, X. Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study. The Lancet. 397, 398-408 (2021).
  2. Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings. Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732 (2022).
  3. Haider, S. Rabies: old disease, new challenges. Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).
  4. Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).
  5. Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. . Rabies and Rabies Vaccines. , (2020).
  6. Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion. The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).
  7. Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis. Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).
  8. Cleland, J. L. Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations. Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).
  9. Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery. Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).
  10. Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria. Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).
  11. Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W. Protein instability in poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles. Pharmaceutical Research. 17 (10), 1159-1167 (2000).
  12. Graf, T. P., et al. A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release. Advanced Materials. , e2300228 (2023).
  13. Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. FDA’s poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes. The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92 (2021).
  14. Wan, Y. Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).
  15. Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic. Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).
  16. McHugh, K. J. Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures. Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).
  17. Sanchez, M. E. N. Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 8149 (2020).
  18. Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres. Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).

Tags

Pulsatile Polymeric MicroparticlesRabies AntigenFabrication3D-printed Master MoldPDMSPLGA FilmSingle-dose VaccineVaccine DeliveryPlatform TechnologyTherapeutic DeliveryProphylactic Delivery

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn, S., Kessler, E., Yang, H., Baryakova, T., Brady, S., McHugh, K. J. Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen. J. Vis. Exp. (195), e65147, doi:10.3791/65147 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image