Kuduz Antijenini Kapsülleyen Pulsatil Polimerik Mikropartiküllerin İmalatı

1. Partikül ana kalıp üretimi NOT: 3D baskı işlemi, yeterli uzamsal çözünürlüğe sahip herhangi bir 3D yazıcı ile gerçekleştirilebilir; Bununla birlikte, mevcut protokol çoklu foton 3D yazıcı için süreci açıklamaktadır. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) programı kullanarak mikroparçacık yapıları tasarlayın.NOT: Tasarım özellikleri aşağıdaki gibidir: 308 parçacık (çap = 400 μm, yükseklik = 500 μm ve duvar kalınlığı = 100 μm), aralarında 600 μm boşluk olacak şekilde 22 x 14 dizide düzenlenmiştir. Tasarım ayrıca dizinin hemen dışında referans olarak dört köşeli bir yıldız ve beş köşeli bir yıldız içerir (Ek Şekil 1). Son tasarımı STL dosyası olarak dışa aktarın (Ek Kodlama Dosyası 1) ve dosyayı aşağıda gösterildiği gibi yazdırma parametrelerini tanımlayabilen bir yazılıma yükleyin. Ardından, 3B yazıcıyla uyumlu bir dosya olarak kaydedin (bkz.NOT: Dilimleme mesafesi = 5 μm, tarama mesafesi = 1 μm, kabuk konturu = 50 μm, taban dilim sayısı = 5 μm, iskele = içi boş, tarama modu = galvo, z ekseni = mikroskop z-sürücüsü, tarama hızı = 100.000, güç = 100. Bir plazma temizleme işlemi (gaz: O2; güç: 200 watt; sıcaklık: 25 °C; akış: 20; zaman: 5 dakika) kullanarak bir silikon baskı substratını (Malzeme Tablosuna bakınız) ön işlemden geçirin, ardından hemen substratı bir cam Petri kabında 30 mL etanol ve 60 μl 3-(trimetoksisilil) propil metakrilat çözeltisine daldırın. Alüminyum folyo ile örtün ve gece boyunca inkübe edilmesine izin verin.NOT: Bu adım, PDMS ayırma işlemi sırasında önemli olan alt tabakaya baskı yapışmasını artırır (adım 2.6). Baskı dosyasını çoklu foton 3D yazıcıya yükleyin, baskı reçinesini işlenmiş alt tabakaya uygulayın, 10x lensi takın (bkz. İşiniz bittiğinde, baskıyı propilen glikol metil eter asetatına (bkz. Malzeme Tablosu) batırarak maruz kalmamış fotodirenci giderin, ardından baskıyı 5 dakika boyunca izopropil alkole batırın. Ana kalıbı 120 dakika boyunca 254 nm’de UV ışığına maruz bırakarak kürleyin.NOT: Varsa, 405 ila 365 nm aralığındaki UV ışığı, basılı yapıları sonradan kürlemek için ~ 20 dakika boyunca kullanılabilir. 2. Polidimetilsiloksan (PDMS) kalıp üretimi 3D baskılı ana kalıbın yüzeyini, yüzeye 40 μL Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H, -perflorooktil) silan eklenmiş bir cam slayt içeren bir vakum odasına yerleştirerek tedavi edin ( bkz. Vakumu çekin (bağıl basınç: -20 inç. Hg) 1 saat boyunca.NOT: Bu adım, kalıp çözme sırasında kolay ayırma sağlar (adım 2.6). Ana kalıp yüzeyi arıtılırken, polidimetilsiloksan (PDMS) prepolimer bazını, kütlece 9: 1 oranında PDMS prepolimer kürleme maddesi ile iyice karıştırın (her ana kalıp için en az 10 g malzeme gerekir). İyice karıştırıldıktan sonra, kürlenmemiş PDMS’yi 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj. Yüzey işlemi tamamlandıktan sonra, ana kalıbı bir alüminyum folyo kabına yerleştirin ve kürlenmemiş PDMS’yi kalıbın üzerine dökün, böylece özelliklerin tamamen suya batırılmasını sağlayın. Alüminyum folyo kabı bir vakum odasına yerleştirin ve vakumu çekin (bağıl basınç: -20 inç. Hg) hava kabarcıklarını gidermek için 1 saat boyunca. Alüminyum folyo kabı vakum odasından çıkarın. Ana kalıbın uçlarına 800 μm ara parçalar yerleştirin ve hava kabarcıklarının karışmasını önlemeye özen göstererek ana kalıbın üzerine temiz bir cam sürgü yerleştirin. Kalıbı ve sürgüyü birbirine sıkıştırmak için bağlayıcı klipsler kullanın, sıkıştırma kuvvetini ara parçalar üzerinde lokalize edin (Ek Şekil 2). Prepolimeri PDMS kalıplarına kürlemek için yapıyı en az 4 saat boyunca 120 ° C’ye ayarlanmış bir fırına yerleştirin. Yapıyı fırından çıkarın, bağlayıcı klipsleri dikkatlice serbest bırakın ve ana kalıbı bir tıraş bıçağı kullanarak kürlenmiş PDMS kalıbından dikkatlice ayırın.NOT: 3D baskılı ana kalıp, ek PDMS kalıpları oluşturmak için yeniden kullanılabilir. 3. PLGA film imalatı 450 mg PLGA’yı tartın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve iç çapı 50,8 mm olan 250 μm kalınlığında bir halka şimi içinde 76 mm x 76 mm’lik yapışmaz bir polimer levha üzerine yerleştirin. PLGA’nın üzerine ikinci bir yapışmaz polimer tabaka yerleştirin ve yığını parmak sızdırmazlığına kadar 101,6 mm’lik bir c-kelepçesi kullanarak iki alüminyum blok arasında sıkıştırın.NOT: Bu çalışmada sadece 502H PLGA kullanılmış; ancak, diğer PLGA türleri bu işlemle uyumludur. C-kelepçeli tertibatı, -30 in.Hg bağıl basınçla, vakum altında 30 dakika boyunca 120 °C’ye ayarlanmış bir vakumlu fırına yerleştirin. Ardından, tertibatı çıkarın ve 30 dakika daha vakumlu fırına geri koymadan önce kelepçeyi sıkıca sıkın.NOT: Vakum kullanmanın temel amacı, yüksek sıcaklıklarda hızlanan PLGA bozulmasını önlemektir. Tertibatı fırından çıkarın ve bir kurutucuda 4 saat soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, kelepçeyi gevşetin, PLGA filmini yapışmaz polimer tabakalardan çıkarın ve filmi etiketli bir Petri kabına yerleştirin. Petri kabını daha sonra kullanmak üzere bir kurutucunun içinde saklayın. 4. PLGA partikül üretimi PDMS kalıbının yüzeyini daha önce adım 2.1’de açıklandığı gibi işlemden geçirin. Cımbız ve/veya neşter kullanarak, 250 μm PLGA filminin bir kısmını, kabaca dizinin büyüklüğünü kesin ve işlenmiş PDMS kalıbına yerleştirin. PLGA filminin ve PDMS kalıbının üzerine temiz bir cam mikroskop sürgüsü yerleştirin ve doğrudan dizinin ve PLGA filminin üzerine bir yaylı kelepçe yerleştirerek bileşenleri birbirine kenetleyin. Kelepçeli kalıp tertibatını 120 °C’ye ayarlanmış vakum fırınına yerleştirin ve vakumu -30 inç bağıl basınçla çekin. 1 saat boyunca Hg.NOT: Parçacıkları oluşturmak için gereken süre PLGA’ya bağlıdır ve 1-12 saat arasında değişebilir. Kelepçeli kalıp tertibatını fırından çıkarın ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika boyunca veya dokunulacak kadar soğuyana kadar pasif olarak soğumaya bırakın. Bir tıraş bıçağı kullanarak, ikisini ayırmak için PDMS kalıbı ile PLGA parçacık dizisi arasına yavaşça basınç uygulayın. PLGA partiküllerini ileride kullanmak üzere bir kurutucuda saklayın. 5. Antijen konsantrasyonu ve saflaştırma Ticari olarak temin edilebilen RABV antijeninin bir alikotunu (bakınız Malzeme Tablosu) oda sıcaklığında çözün. İki toplama tüpüne 100 kDa moleküler ağırlık kesmeli iki santrifüj spin filtresi (MWCO; bakınız Malzeme Tablosu) yerleştirerek filtreleme kurulumunu birleştirin. İki santrifüjlü sıkma filtresini 500 μL UltraPure su ekleyerek önceden ıslatın. Filtreleri oda sıcaklığında bir tezgah üstü santrifüjde 1 dakika boyunca 2.400 x g’de döndürün. 200 μL pipet kullanarak filtreleme kurulumunun hem üst hem de alt bölmelerindeki suyu çıkarın.NOT: Önceden ıslatılmış sıkma filtresinin kurumasına izin vermeyin. Her bir sıkma filtresinin üst bölmesine 400 μL damıtılmış su ekleyin, ardından 100 μL çözünmüş RABV antijeni ekleyin ve pipetle karıştırın.NOT: Bu çalışma antijeni yaklaşık beş kat yoğunlaştırdı ve eksipiyanların konsantrasyonunu ~ 50 kat <100 kDa azalttı. İki santrifüj dönüş filtresini bir tezgah üstü santrifüje yerleştirin ve filtrelerin santrifüjün merkezine bakmasını sağlayın. Filtrenin hangi tarafının santrifüjün merkezine doğru baktığını işaretleyin.NOT: Yanlış yönlendirilirse, çözeltiler uygun şekilde filtrelenmez/konsantre edilmez. Filtreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.000 x g’de santrifüj edin. Filtreleri santrifüjden alın. Toplama tüpleri filtratı içerecek, filtreler ise konsantre numuneyi içerecektir (Ek Şekil 3A). Toplama tüplerindeki filtratı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın. Her filtreye 450 μL filtrelenmiş damıtılmış su ekleyin ve konsantre numune ile suyu altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. İki spin filtresini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.000 x g’de ikinci kez santrifüj edin. Filtrelerin santrifüjün merkezine adım 5.7’deki gibi aynı yönde baktığından emin olun. Filtre ünitelerini santrifüjden alın ve daha önce olduğu gibi, bir pipet kullanarak filtratı her tüpten çıkarın ve atın. Sıkma filtrelerini toplama tüplerinden çıkarın ve toplama tüplerinin üst kısmını kullanarak filtre muhafazalarını kapatın (Ek Şekil 3B). Filtre muhafazalarını dik ve 45° açılarda tutarken 30 sn boyunca 3.000 rpm’de spin filtresi muhafazalarının tabanını doğrudan bir vorteks ve vorteks üzerine yerleştirin (Ek Şekil 3C).NOT: Bu adım, santrifüjleme işlemi sırasında bir pelet oluşturan herhangi bir RABV antijenini yeniden askıya almayı amaçlamaktadır. Toplama borularının kapağını sıkma filtresi muhafazalarından dikkatlice çıkarın. Filtre muhafazalarını birlikte verilen toplama tüplerine geri yerleştirin ve kapakta sıkışmış olabilecek herhangi bir hacmi toplamak için hızlı bir dönüş (2-3 s) çalıştırın.NOT: Bu hızlı döndürme, tezgah üstü mikrosantrifüjde gerçekleştirilmelidir. Filtreler, filtrelerden hiçbir çözelti kaybolmamasını sağlamak için önceki konfigürasyonun aksine, santrifüje teğet geçmelidir. Her bir sıkma filtresi ünitesini, sıkma filtresi kiti ile birlikte verilen yeni bir toplama tüpüne ters çevirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve konsantre numuneleri toplamak için oda sıcaklığında 1.000 x g’de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. İki toplama tüpündeki konsantre numuneleri tek bir toplama tüpünde birleştirin. Elde edilen hacmi ölçün ve kaydedin.NOT: Elde edilen numune, stok olarak başlangıçtaki antijen konsantrasyonunun 5 katına sahip olacak, stoktan yaklaşık 50 kat daha düşük küçük bir eksipiyan (<100 kDa) konsantrasyonuna sahip olacak ve hafif süt beyazı görünecektir. Toplam hacim yaklaşık 44-48 μL olmalıdır. 5x konsantre, iki kez yıkanmış antijeni, dağıtım zamanına kadar 4 ° C’de, ancak 16 saatten fazla olmamak üzere saklayın. Partikülleri bu çözelti ile doldurmadan önce, herhangi bir kabarcığı gidermek için tüpü 1 dakika boyunca 1.000 x g’de santrifüj edin. Çözelti, dağıtım için nominal hedef konsantrasyona ulaşmak için damıtılmış su kullanılarak seyreltilebilir. 6. Partikül doldurma 0,22 μm’lik bir vakum filtresinden 500 mL deiyonize suyu vakum filtresiyle filtreleyin, ardından bir vakum uygulayarak çözeltinin gazını giderin (bağıl basınç: -20 inç. Hg) 20 dakika boyunca sonikasyon altındayken. Bu süre zarfında, piezo dağıtım kılcal damarlarını (PDC’ler; bakınız Malzeme Tablosu) piezoelektrik dağıtıcıya takın. Makineyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve PLGA parçacıkları ile slaytı dağıtım alanına yerleştirin. Ek Şekil 4’e göre “Hedef Referans Noktalarını Bul”u ayarlayın, Çalıştırın ve ardından “Hedef Alt Tabakayı” ayarlayın. Konsantre antijenin 25 μL’sini kaynak plakasına yükleyin ve makineye yükleyin. PDC’leri kullanarak, dağıtım ucuna 10 μL konsantre antijen aspire edin, ucun dışını yıkayın, ardından dağıtım hizalamasını kalibre edin (Ek Şekil 5). “Hedef Kurulum parametreleri” girin ve Çalıştır’a tıklayın (Ek Şekil 6). Tamamlandığında, doldurulmuş parçacıkları çıkarın ve bir stereoskop altında doldurulduklarını doğrulayın. Doğrudan protokoldeki bir sonraki adıma geçin. 7. Partikül sızdırmazlığı ve hasadı Bir ocak plakasına paslanmaz çelik bir blok yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu). Paslanmaz çelik bloğun üzerine iki mikroskop slaytı yerleştirin, böylece paralel olurlar. Paslanmaz çelik bloğun düz olduğundan emin olun, ardından ocak plakasını açın ve sıcaklığı paslanmaz çeliğin yüzey sıcaklığı 200 ° C olacak şekilde ayarlayın. Sızdırmazlıktan önce ocak plakasının sıcaklığını doğrulayın. Doldurulmuş PLGA parçacıklarını iki cam slaytın üzerine yerleştirerek ocak plakasının üzerinde askıya alın, ardından hemen 18 sn için bir zamanlayıcı başlatın.NOT: Sızdırmazlık için gereken zaman ve ısı parçacıklarının miktarı, parçacıkları yapmak için kullanılan PLGA’nın kimyasal özelliklerine bağlı olarak değişecektir. Slaytları ocaktan güvenli bir mesafede tutmak için özel bir 3D baskılı slayt tutucu kullanılabilir. STL dosyası Ek Kodlama Dosyası 2 olarak sağlanır. Kapatıldıktan sonra, parçacık dizisini ocaktan çıkarın ve parçacık dizisini iki ayrı cam slayta yerleştirerek laboratuvar tezgahının üzerine asın. Parçacıkların 1 dakika soğumasını bekleyin. Soğutulduktan sonra, parçacıklar bir stereoskoptan bakarken bir neşter kullanılarak toplanabilir. Neşteri bıçakla slayta 45° açıyla tutun ve cam kızaktan ayırmak için parçacığın tabanına basınç uygulayın. Hasat edildikten sonra, parçacıkları 0,5 mL düşük proteinli bağlayıcı tüplere aktarmak için neşteri kullanın (bkz. Ardından, tüpleri 30 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 1 mg / mL glikoz içeren 250 μL 1x fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile doldurun.NOT: PBS’de hazırlanan 30 mg/mL BSA ve 1 mg/mL glukoz çözeltisi RABV antijeninin stabilitesini koruyacaktır. Bir çift ince uçlu cımbız kullanarak parçacıkları stereoskop altında ezin. Parçacığın çekirdeğindeki RABV antijeninin çevreleyen çözelti içinde çözünmeye hazır olduğundan emin olun. Antijen potansiyeli bir ELISA kullanılarak değerlendirilene kadar numuneleri 4 ° C’lik bir buzdolabında saklayın. Numuneler, hazırlandıktan sonraki 7 gün içinde bir ELSIA’da çalıştırılmalıdır. 8. Antijenin ELISA ile değerlendirilmesi DİKKAT: Mikro plakaların hiçbir noktada kurumasına izin vermeyin. Her zaman plakaları istifleyin ve kurumasını önlemek için üst plakayı daima plastik bir conta, boş bir plaka veya bir kapakla örtün. Arabellekleri Ek Dosya 1’de belirtildiği gibi hazırlayın. pH 9.4-9.6’da 4975 μL kaplama tamponuna 25 μL kaplama antikoru ekleyerek 2.5 μg/mL konsantrasyonda 5 mL kaplama çözeltisi (karbonat-bikarbonat tamponu, pH 9.6) hazırlayın.NOT: Her biri 50 μL olan 96 kuyucuğu kaplamak için 5 mL gereklidir (pipetleme kaybı için ekstra hacimle). Gerekli her ilave ELISA plakası için toplam hacmi 5 mL artırın. Mikroplakanın her bir kuyucuğuna 50 μL kaplama çözeltisi dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Çözelti, hazırlandıktan hemen sonra kaplama için kullanılmalıdır. Her bir kuyucuğun tabanının sıvı ile eşit şekilde kaplandığından emin olmak için eldivenli bir avuç içi üzerinde plaka kenarları boyunca hafifçe hafifçe vurun. Plakayı yapışkan filmle kapatın ve 1 saat boyunca 37 ° C’ye yerleştirin, ardından gece boyunca 4 ° C’ye aktarın. Plakaları soğuk hava deposundan alın ve her bir kuyucukta 200 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkama tamponunu çıkarın ve her bir kuyucuğa 300 μL blokaj tamponu dağıtın.DİKKAT: Farklı plakalarda tekrarlanan aynı numunelerle birden fazla plaka çalıştırırken, plaka plaka ilerlemek önemlidir (yani, plaka 2’ye geçmeden önce plaka 1’i malzeme ile doldurun ve ardından plaka 3’e vb.). X malzemesini tüm plakalara ve daha sonra Y malzemesine vb. uygulamayın, çünkü bu, kuyuların kuruma riskini artırır. Son yıkama adımından sonra, yıkama tamponu plakanın kuyucuklarında kalmalı ve sadece plakaya numune eklemeden hemen önce atılmalıdır. ELISA plakasının hemen dağıtılmayan tüm kuyucuklarını örtmek için plastik bir 96 delikli plaka kapağı kullanılmalı ve kapak, malzeme ile doldurulacak ek kuyucukları ortaya çıkarmak için sırayla hareket ettirilmelidir. Plakaları yapışkan plastik bir filmle kapatın (bakınız Malzeme Tablosu) ve 37 ± 2 ° C’de 60 ± 5 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Bu inkübasyon sırasında değerlendirilecek standart eğriyi ve test numunelerini hazırlayın.NOT: Değerlendirilen antijen, pipetleme kaybını hesaba katmak için önerilen 0,125 IU/mL seyreltmede seyreltici tamponda önceden seyreltilmeli ve en az 40 μL’lik bir aşırı hacim sağlanmalıdır. Tüm numuneler her bir ELISA plakasında çift (iki teknik kopya) olarak değerlendirilir. Standart eğri için, her bir ELISA plakasının 2. ve 3. sütunlarına toplam sekiz noktadan oluşan iki katlı bir seyreltme serisi dahil edilmelidir. Değerlendirilmekte olan tahmini antijen miktarına bağlı olarak uygun sayıda noktaya sahip diğer tüm numuneler için bir seyreltme serisi gerçekleştirilebilir. Daha yüksek verim için daha az titiz olmasına rağmen, yukarıda açıklanan kaplamaya alternatif olarak tek bir numune seyreltme kullanılabilir. Bununla birlikte, tek bir seyreltmenin beklenen konsantrasyonu standart eğri aralığında olmalıdır. Düşük bağlı protein 96 delikli plakalarda veya düşük bağlı protein tüplerinde ( bakınız Malzeme Tablosu), plakanın sütunları boyunca her numunenin iki katlı seyreltme serisini gerçekleştirin. Her bir ilgili numune için seyreltme serisinin başlangıcını gereken son hacmin iki katı kadar A satırına yükleyin (plaka başına, kuyucuk başına 100 μL numune gerekir, bu nedenle A2-A11’deki tüm kuyucuklar en az 240 μL numune içermeli ve pipetleme kaybını hesaba katmak için ekstra hacim 40 μL olmalıdır). Düşük bağlı protein plakasındaki diğer tüm kuyucuklara 120 μL seyreltici tampon yükleyin, sütun 1 ve 12 hariç (yani, B2 ila H11). 10 uçlu çok kanallı bir pipet kullanarak, 120 μL numuneyi A2-A11’den B2-B11’e aktararak ve sıçramayı ve kabarcıkları önlerken karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek seri seyreltme gerçekleştirin. Bu işlemi tekrarlayın, plakayı sütunlar boyunca H2-H11 kuyularına kadar hareket ettirin. Son kuyu sırasından aspire edilen kalan 120 μL hacmini atın.NOT: Numuneler artık analiz için hazırdır. Blokaj aşaması bu zamana kadar tamamlanmazsa, numunelerin buz üzerinde tutulduğundan emin olun. Kuluçka adımının sonunda, plakaları 200 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Çok kanallı pipet kullanarak 100 μL seyreltici tamponu sütun 1 ve 12’ye “boşluklar” olarak aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, numune seyreltmeleri içeren düşük bağlanmış protein 96 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 100 μL’yi yıkanmış ELISA plakasına aktarın. Çalıştırılan tüm ELISA plakaları için bu işlemi tekrarlayın. Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve 37 ± 2 ° C’de 60 ± 5 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Seyreltici tamponun 10.995,6 μL’sine 4,4 μL antikor çözeltisi ekleyerek algılama antikor çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 0,2 μg/mL konsantrasyonda hazırlayın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.NOT: Her biri 100 μL’de 96 kuyu için toplam 11 mL gereklidir (pipetleme kayıpları için ekstra hacim ile). Değerlendirilen her ilave ELISA plakası için toplam hacmi 11 mL artırın. Çözelti hazırlıktan hemen sonra kullanılmalıdır. Kuluçka adımının sonunda, plakaları 200 μL yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Kalan yıkama tamponunu aspire edin ve çok kanallı bir pipet kullanarak mikroplakadaki her bir kuyucuğa 100 μL algılama antikor çözeltisi dağıtın. Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve 37 ± 2 ° C’de 60 ± 5 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. 10.995.6 μL yıkama tamponuna 4.4 μL streptavidin-peroksidaz konjugat çözeltisi ( bakınız Malzeme Tablosu) ekleyerek konjugatı tespit antikor inkübasyon adımının sonuna doğru hazırlayın.NOT: Her biri 100 μL’de 96 kuyucuk için toplam 11 mL gereklidir (çok kanallı pipetleme için ekstra hacim ile). Değerlendirilen her ilave ELISA plakası için toplam hacmi 11 mL artırın. Plakaları 200 μL yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Kalan yıkama tamponunu aspire edin ve her bir kuyucuğa 100 μL konjuge çözelti dağıtın. Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve 37 ± 2 ° C’de 60 ± 5 dakika boyunca 37 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Son yıkama adımı sırasında alt tabakayı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz. Her plaka için, bir tablet o-fenilendiamin dihidroklorür (OPD; bakınız Malzeme Tablosu) karanlıkta 9 mL deiyonize su içinde çözün, ardından 1 mL 10x stabil peroksit tamponu ile doldurun. Değerlendirilen plaka sayısına göre tablet sayısını ve toplam çözelti hacmini (10 mL) ayarlayın. Plakaları 200 μL yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 100 μL substrat dağıtın. Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve alüminyum folyo kullanarak ışıktan korunmuş 10-20 dakika boyunca tezgahta bırakın.NOT: Doygunluğu önlemek için renk gelişimini görsel olarak izleyin. Her bir kuyucuğa 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve 492 nm’de absorbans ve 620 nm’lik bir referans absorbansı için hemen okuma plakasını ekleyin. Düzeltilmiş absorbans okumasını kullanarak verileri analiz edin (492 nm’de okuma eksi 620 nm’de okuma) ve boşluğun ortalamasını tüm örneklerden çıkarın. Absorbans değerlerini IU/mL’ye dönüştürmek için sigmoidal 4PL enterpolasyon yöntemi kullanın. Son olarak, IU’ya dönüştürmek için 250 μL (toplam numune hacmi) ile çarpın.NOT: Bu analiz, veri analiz yazılımı kullanılarak yapılabilir.