Herstellung pulsatiler polymerer Mikropartikel, die das Tollwutantigen verkapseln

1. Generierung von Partikel-Urformen HINWEIS: Der 3D-Druckprozess kann mit jedem 3D-Drucker mit ausreichender räumlicher Auflösung durchgeführt werden. Das aktuelle Protokoll beschreibt jedoch das Verfahren für einen Multi-Photonen-3D-Drucker. Entwerfen Sie Mikropartikelstrukturen mit einem CAD-Programm (Computer Aided Design).HINWEIS: Die Konstruktionsspezifikationen lauten wie folgt: 308 Partikel (Durchmesser = 400 μm, Höhe = 500 μm und Wandstärke = 100 μm) sind in einem 22 x 14 großen Array mit einem Abstand von 600 μm angeordnet. Das Design enthält auch einen vierzackigen Stern und einen fünfzackigen Stern als Passermarken unmittelbar außerhalb des Arrays (ergänzende Abbildung 1). Exportieren Sie das endgültige Design als STL-Datei (Supplementary Coding File 1) und laden Sie die Datei in eine Software hoch, die in der Lage ist, die Druckparameter wie unten gezeigt zu definieren. Speichern Sie es dann als Datei, die mit dem 3D-Drucker kompatibel ist (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Schnittabstand = 5 μm, Schraffurabstand = 1 μm, Schalenkontur = 50 μm, Anzahl der Basisschichten = 5 μm, Gerüst = hohl, Scanmodus = Galvo, Z-Achse = Mikroskop-Z-Antrieb, Scangeschwindigkeit = 100.000, Leistung = 100. Behandeln Sie ein Silizium-Drucksubstrat (siehe Materialtabelle) mit einem Plasmareinigungsverfahren (Gas: O2; Leistung: 200 Watt; Temperatur: 25 °C; Durchfluss: 20; Zeit: 5 min) vor und tauchen Sie das Substrat dann sofort in eine Lösung aus 30 ml Ethanol und 60 μl 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat in einer Glas-Petrischale. Mit Alufolie abdecken und über Nacht inkubieren lassen.HINWEIS: Dieser Schritt erhöht die Druckhaftung auf dem Substrat, was bei der PDMS-Trennung (Schritt 2.6) wichtig ist. Laden Sie die Druckdatei auf den Multiphotonen-3D-Drucker hoch, tragen Sie das Druckharz auf das behandelte Substrat auf, laden Sie die 10-fach-Linse (siehe Materialtabelle) und drucken Sie die Mikrostrukturen. Wenn Sie fertig sind, tauchen Sie den Druck 45 Minuten lang in Propylenglykolmethyletheracetat (siehe Materialtabelle), um unbelichteten Fotolack zu entfernen, und tauchen Sie den Druck dann 5 Minuten lang in Isopropylalkohol ein. Härten Sie die Urform nach, indem Sie sie 120 Minuten lang UV-Licht bei 254 nm aussetzen.HINWEIS: Falls verfügbar, kann UV-Licht im Bereich von 405 bis 365 nm für ~20 min verwendet werden, um die gedruckten Strukturen nachzuhärten. 2. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Schimmelpilzen Behandeln Sie die Oberfläche der 3D-gedruckten Urform, indem Sie sie in eine Vakuumkammer legen, die einen Glasobjektträger enthält, dem 40 μl Trichlor(1H,1H,2H,2H,-perfluoroctyl) (siehe Materialtabelle) Silan zugesetzt werden. Ziehen Sie das Vakuum (relativer Druck: -20 Zoll. Hg) für 1 h.HINWEIS: Dieser Schritt sorgt für eine einfache Trennung beim Entformen (Schritt 2.6). Während die Oberfläche der Urform behandelt wird, mischen Sie die Prepolymerbasis von Polydimethylsiloxan (PDMS) gründlich mit dem PDMS-Präpolymerhärter in einem Masseverhältnis von 9:1 (für jede Urform werden mindestens 10 g Material benötigt). Nach dem gründlichen Mischen wird das nicht ausgehärtete PDMS in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 300 x g 3 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Sobald die Oberflächenbehandlung abgeschlossen ist, legen Sie die Urform in eine Aluminiumfolienschale und gießen Sie das nicht ausgehärtete PDMS auf die Form, um sicherzustellen, dass die Merkmale vollständig untergetaucht sind. Stellen Sie die Aluminiumfolienschale in eine Vakuumkammer und ziehen Sie das Vakuum (relativer Druck: -20 Zoll. Hg) für 1 h, um Luftblasen zu entfernen. Nehmen Sie die Aluminiumfolienschale aus der Vakuumkammer. Platzieren Sie 800-μm-Abstandshalter an den Enden der Urform und legen Sie einen sauberen Glasschieber auf die Urform, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen entstehen. Verwenden Sie Binderklammern, um die Form und den Schieber zusammenzuklemmen und die Schließkraft über den Abstandshaltern zu lokalisieren (ergänzende Abbildung 2). Legen Sie die Struktur für mindestens 4 h in einen auf 120 °C eingestellten Ofen, um das Prepolymer in PDMS-Formen auszuhärten. Nehmen Sie die Struktur aus dem Ofen, lösen Sie vorsichtig die Binderklammern und trennen Sie die Urform vorsichtig mit einer Rasierklinge von der ausgehärteten PDMS-Form.HINWEIS: Die 3D-gedruckte Urform kann wiederverwendet werden, um weitere PDMS-Formen zu generieren. 3. Herstellung von PLGA-Folien Wiegen Sie 450 mg PLGA (siehe Materialtabelle) ab und legen Sie es auf eine 76 mm x 76 mm große antihaftbeschichtete Polymerfolie in einer 250 μm dicken Ringunterlegscheibe mit einem Innendurchmesser von 50,8 mm. Legen Sie eine zweite antihaftbeschichtete Polymerfolie über den PLGA und drücken Sie den Stapel mit einer 101,6-mm-C-Klemme zwischen zwei Aluminiumblöcken zusammen, bis er fingerfest ist.HINWEIS: In dieser Studie wurde ausschließlich 502H PLGA verwendet. Andere PLGA-Typen sind jedoch mit diesem Verfahren kompatibel. Legen Sie die c-gespannte Baugruppe für 30 Minuten unter Vakuum mit einem Relativdruck von -30 Zoll in einen Vakuumofen, der auf 120 °C eingestellt ist. Entfernen Sie dann die Baugruppe und ziehen Sie die Klemme fest an, bevor Sie sie für weitere 30 Minuten wieder in den Vakuumofen stellen.Anmerkungen: Der Hauptzweck der Verwendung eines Vakuums besteht darin, eine PLGA-Degradation zu vermeiden, die bei hohen Temperaturen beschleunigt wird. Nehmen Sie die Baugruppe aus dem Ofen und lassen Sie sie 4 Stunden in einem Exsikkator abkühlen. Lösen Sie nach dem Abkühlen die Klemme, entfernen Sie die PLGA-Folie von den antihaftbeschichteten Polymerfolien und legen Sie die Folie in eine beschriftete Petrischale. Bewahren Sie die Petrischale zur späteren Verwendung in einem Exsikkator auf. 4. Erzeugung von PLGA-Partikeln Behandeln Sie die Oberfläche der PDMS-Form wie zuvor in Schritt 2.1 beschrieben. Schneiden Sie mit einer Pinzette und/oder einem Skalpell einen Teil der 250 μm PLGA-Folie, etwa die Größe des Arrays, aus und legen Sie ihn auf die behandelte PDMS-Form. Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die PLGA-Folie und die PDMS-Form und klemmen Sie die Komponenten zusammen, indem Sie eine Federklemme direkt über das Array und die PLGA-Folie legen. Legen Sie die eingespannte Formbaugruppe in den auf 120 °C eingestellten Vakuumofen und ziehen Sie das Vakuum mit einem Relativdruck von -30 Zoll. Hg für 1 h.HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um die Partikel zu bilden, hängt vom PLGA ab und kann zwischen 1 und 12 Stunden variieren. Nehmen Sie die eingespannte Formbaugruppe aus dem Ofen und lassen Sie sie ca. 15 Minuten bei Raumtemperatur passiv abkühlen oder bis sie sich kühl anfühlt. Üben Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig Druck zwischen der PDMS-Form und dem PLGA-Partikelarray aus, um die beiden zu trennen. Bewahren Sie die PLGA-Partikel für die spätere Verwendung in einem Exsikkator auf. 5. Antigenkonzentration und -reinigung Tauen Sie ein Aliquot des handelsüblichen RABV-Antigens (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur auf. Montieren Sie den Filtrationsaufbau, indem Sie zwei Zentrifugal-Spin-Filter mit einem Molekulargewichts-Grenzwert von 100 kDa (MWCO; siehe Materialtabelle) in zwei Sammelröhrchen einsetzen. Befeuchten Sie die beiden Zentrifugal-Schleuderfilter durch Zugabe von 500 μl Reinstwasser. Schleudern Sie die Filter bei 2.400 x g für 1 Minute in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Wasser sowohl aus dem oberen als auch aus dem unteren Fach des Filtrationsaufbaus mit einer 200-μl-Pipette.HINWEIS: Lassen Sie den vorgefeuchteten Schleuderfilter nicht austrocknen. Geben Sie 400 μl destilliertes Wasser in das obere Fach jedes Spinfilters, fügen Sie dann 100 μl des aufgetauten RABV-Antigens hinzu und mischen Sie es mit der Pipette.Anmerkungen: In dieser Studie wurde das Antigen etwa um das Fünffache konzentriert und die Konzentration der Hilfsstoffe <100 kDa um das ~50-fache reduziert. Legen Sie die beiden Zentrifugal-Schleuderfilter in eine Tischzentrifuge und achten Sie darauf, dass die Filter zur Mitte der Zentrifuge zeigen. Markieren Sie, welche Seite des Filters zur Mitte der Zentrifuge zeigt.Anmerkungen: Bei falscher Ausrichtung werden die Lösungen nicht richtig gefiltert/konzentriert. Zentrifugieren Sie die Filter bei 14.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Holen Sie die Filter aus der Zentrifuge. Die Sammelröhrchen enthalten das Filtrat, während die Filter die konzentrierte Probe enthalten (ergänzende Abbildung 3A). Entfernen Sie das Filtrat in den Auffangröhrchen mit einer Pipette und entsorgen Sie es. Geben Sie 450 μl gefiltertes destilliertes Wasser in jeden Filter und mischen Sie die konzentrierte Probe und das Wasser, indem Sie sechsmal auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die beiden Schleuderfilter ein zweites Mal bei 14.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Filter in der gleichen Ausrichtung wie in Schritt 5.7 zur Mitte der Zentrifuge zeigen. Entnehmen Sie die Filtereinheiten aus der Zentrifuge und entnehmen Sie wie zuvor das Filtrat aus jedem Röhrchen mit einer Pipette. Entfernen Sie die Schleuderfilter aus den Auffangröhrchen und verschließen Sie die Filtergehäuse mit der Oberseite der Auffangröhrchen (ergänzende Abbildung 3B). Legen Sie die Unterseite der Schleuderfiltergehäuse direkt auf einen Wirbel und wirbeln Sie 30 s lang bei 3.000 U/min, während Sie die Filtergehäuse aufrecht und in einem Winkel von 45° halten (ergänzende Abbildung 3C).HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, jedes RABV-Antigen zu resuspendieren, das während des Zentrifugationsprozesses ein Pellet gebildet hat. Entfernen Sie vorsichtig die Kappe der Auffangröhrchen von den Schleuderfiltergehäusen. Setzen Sie die Filtergehäuse wieder in die mitgelieferten Auffangröhrchen ein und führen Sie eine schnelle Drehung (2-3 s) durch, um das Volumen aufzufangen, das möglicherweise in der Kappe eingeschlossen ist.Anmerkungen: Diese schnelle Drehung muss in einer Tischmikrozentrifuge durchgeführt werden. Die Filter sollten tangential zur Zentrifuge angeordnet sein, entgegen der vorherigen Konfiguration, um sicherzustellen, dass keine Lösung durch die Filter verloren geht. Jede Spinfiltereinheit wird in ein neues, mit dem Spinfilter-Kit geliefertes Sammelrohr (siehe Materialtabelle) eingesetzt und 2 Minuten lang bei 1.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die konzentrierten Proben zu sammeln. Konsolidieren Sie die konzentrierten Proben aus den beiden Sammelröhrchen zu einem Sammelröhrchen. Messen und notieren Sie das resultierende Volumen.HINWEIS: Die resultierende Probe hat das 5-fache der ursprünglichen Antigenkonzentration wie der Stamm, hat eine geringe Hilfsstoffkonzentration (<100 kDa), die etwa 50-fach niedriger ist als die des Stammes, und erscheint leicht milchigweiß. Das Gesamtvolumen sollte ca. 44-48 μl betragen. Lagern Sie das 5x konzentrierte, zweimal gewaschene Antigen bei 4 °C bis zum Zeitpunkt der Abgabe, jedoch nicht länger als 16 h. Bevor Sie Partikel mit dieser Lösung füllen, zentrifugieren Sie das Röhrchen 1 Minute lang bei 1.000 x g , um alle Blasen zu entfernen. Die Lösung kann mit destilliertem Wasser verdünnt werden, um die nominale Zielkonzentration für die Dosierung zu erreichen. 6. Partikelfüllung Vakuumfilter 500 ml deionisiertes Wasser durch einen 0,22 μm Vakuumfilter, dann entgasen Sie die Lösung durch Anlegen eines Vakuums (Relativdruck: -20 Zoll. Hg) unter Beschallung für 20 min. Befestigen Sie während dieser Zeit die Piezo-Dispense-Kapillaren (PDCs; siehe Materialtabelle) am piezoelektrischen Dispenser. Grundieren Sie das Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Objektträger mit den PLGA-Partikeln in den Dosierbereich. Richten Sie die Option “Zielreferenzpunkte suchen”, “Ausführen” und dann das “Zielsubstrat ” gemäß ergänzender Abbildung 4 ein. Laden Sie 25 μl des konzentrierten Antigens in die Ausgangsplatte und laden Sie es in die Maschine. Aspirieren Sie mit den PDCs 10 μl konzentriertes Antigen in die Dosierspitze, waschen Sie die Außenseite der Spitze und kalibrieren Sie dann die Dosierausrichtung (ergänzende Abbildung 5). Geben Sie “Target Setup parameters” ein und klicken Sie auf Ausführen (ergänzende Abbildung 6). Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die gefüllten Partikel und überprüfen Sie, ob sie unter einem Stereoskop gefüllt sind. Fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt im Protokoll fort. 7. Partikelversiegelung und -ernte Legen Sie einen Edelstahlblock (siehe Materialtabelle) auf eine Kochplatte. Legen Sie zwei Objektträger parallel auf den Edelstahlblock. Stellen Sie sicher, dass der Edelstahlblock waagerecht ist, schalten Sie dann die Kochstelle ein und stellen Sie die Temperatur so ein, dass die Oberflächentemperatur des Edelstahls 200 °C beträgt. Überprüfen Sie vor dem Versiegeln die Temperatur der Kochstelle. Hängen Sie die gefüllten PLGA-Partikel über der Kochplatte, indem Sie sie auf die beiden Glasobjektträger legen, und starten Sie dann sofort einen Timer für 18 s.HINWEIS: Die Zeit und die Wärme, die Partikel zum Versiegeln benötigen, hängen von den chemischen Eigenschaften des PLGA ab, das zur Herstellung der Partikel verwendet wird. Ein kundenspezifischer 3D-gedruckter Objektträgerhalter kann verwendet werden, um die Objektträger in sicherem Abstand von der Kochplatte zu handhaben. Die STL-Datei wird als ergänzende Codierungsdatei 2 bereitgestellt. Entfernen Sie nach dem Versiegeln das Partikelarray von der Kochplatte und hängen Sie es über den Labortisch, indem Sie das Partikelarray auf zwei separate Glasobjektträger legen. Lassen Sie die Partikel 1 Minute abkühlen. Nach dem Abkühlen können die Partikel mit einem Skalpell geerntet werden, während man durch ein Stereoskop schaut. Halten Sie das Skalpell mit der Klinge in einem 45°-Winkel zum Objektträger und üben Sie Druck auf die Basis des Partikels aus, um es vom Objektträger zu trennen. Nach der Ernte werden die Partikel mit dem Skalpell in 0,5 ml proteinarme Binderöhrchen überführt (siehe Materialtabelle). Füllen Sie dann die Röhrchen mit 250 μl einer 1x Phosphatpufferlösung (PBS), die 30 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mg/ml Glukose enthält.HINWEIS: Die in PBS hergestellte 30 mg/ml BSA- und 1 mg/ml-Glukoselösung erhält die Stabilität des RABV-Antigens. Zerkleinern Sie die Partikel unter einem Stereoskop mit einer Pinzette mit feiner Spitze. Stellen Sie sicher, dass das RABV-Antigen im Kern des Partikels verfügbar ist, um in der umgebenden Lösung gelöst zu werden. Lagern Sie die Proben in einem Kühlschrank bei 4 °C, bis die Antigenpotenz mit einem ELISA bewertet werden kann. Die Proben müssen innerhalb von 7 Tagen nach der Aufbereitung auf einem ELSIA behandelt werden. 8. Bewertung des Antigens mittels ELISA ACHTUNG: Lassen Sie die Mikrotiterplatten zu keinem Zeitpunkt austrocknen. Stapeln Sie die Teller immer und decken Sie die obere Platte immer mit einer Plastikdichtung, einem leeren Teller oder einem Deckel ab, um ein Austrocknen zu vermeiden. Bereiten Sie die Puffer wie in Ergänzungsdatei 1 beschrieben vor. Bereiten Sie 5 ml Beschichtungslösung (Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6) in einer Konzentration von 2,5 μg/ml vor, indem Sie 25 μl des Beschichtungsantikörpers zu 4975 μl Beschichtungspuffer bei einem pH-Wert von 9,4-9,6 hinzufügen.HINWEIS: 5 ml werden benötigt, um 96 Wells mit je 50 μl zu beschichten (mit zusätzlichem Volumen für Pipettierverluste). Erhöhen Sie das Gesamtvolumen um 5 ml für jede zusätzlich benötigte ELISA-Platte. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl der Beschichtungslösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte zu dosieren. Die Lösung muss unmittelbar nach der Herstellung zum Beschichten verwendet werden. Klopfen Sie vorsichtig an den Tellerrändern einer behandschuhten Handfläche entlang, um sicherzustellen, dass der Boden jeder Vertiefung gleichmäßig mit Flüssigkeit bedeckt ist. Verschließen Sie die Platte mit Klebefolie und legen Sie sie 1 h lang auf 37 °C, dann über Nacht auf 4 °C umstellen. Holen Sie die Platten aus dem Kühlhaus und waschen Sie sie dreimal mit 200 μl Waschpuffer in jeder Vertiefung. Entfernen Sie den Waschpuffer und geben Sie 300 μl Blockierpuffer in jede Vertiefung.VORSICHT: Wenn mehrere Platten mit denselben Proben auf verschiedenen Platten wiederholt werden, ist es wichtig, Platte für Platte vorzugehen (d. h. Platte 1 mit dem Material zu füllen, bevor Sie mit Platte 2 und dann mit Platte 3 fortfahren und so weiter). Tragen Sie nicht Material X auf alle Platten und dann Material Y usw. auf, da dies das Risiko des Austrocknens von Brunnen erhöhen würde. Nach dem letzten Waschschritt sollte der Waschpuffer in den Vertiefungen der Platte verbleiben und erst unmittelbar vor der Zugabe von Proben zur Platte verworfen werden. Ein 96-Well-Plattendeckel aus Kunststoff muss verwendet werden, um alle Vertiefungen der ELISA-Platte abzudecken, in die nicht sofort dosiert wird, und der Deckel muss nacheinander bewegt werden, um zusätzliche Vertiefungen freizulegen, die mit Material gefüllt werden sollen. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen Inkubator. Bereiten Sie die Standardkurve vor und testen Sie die Proben, die während dieser Inkubation ausgewertet werden sollen.HINWEIS: Das zu bewertende Antigen muss in Verdünnungspuffer mit einer empfohlenen Verdünnung von 0,125 IU/ml mit einem überschüssigen Volumen von mindestens 40 μl vorverdünnt werden, um den Pipettierverlust zu berücksichtigen. Alle Proben werden in zweifacher Ausführung (zwei technische Replikate) auf jeder ELISA-Platte ausgewertet. Für die Standardkurve sollte in den Spalten 2 und 3 jeder ELISA-Platte eine zweifache Verdünnungsreihe für insgesamt acht Punkte enthalten sein. Für alle anderen Proben kann eine Verdünnungsreihe mit einer angemessenen Anzahl von Punkten basierend auf der vorhergesagten Menge des zu bewertenden Antigens durchgeführt werden. Obwohl sie für einen höheren Durchsatz weniger streng ist, kann eine einzelne Probenverdünnung als Alternative zu der oben beschriebenen Beschichtung verwendet werden. Die zu erwartende Konzentration einer einzelnen Verdünnung muss jedoch innerhalb des Standardkurvenbereichs liegen. Führen Sie in 96-Well-Proteinplatten mit geringer Bindung oder in Proteinröhrchen mit geringer Bindung (siehe Materialtabelle) eine zweifache Verdünnungsreihe jeder Probe entlang der Säulen der Platte durch. Laden Sie den Beginn der Verdünnungsreihe in Zeile A für jede jeweilige Probe mit dem doppelten des erforderlichen Endvolumens (pro Platte sind 100 μl Probe pro Well erforderlich, daher sollten alle Wells in A2-A11 mindestens 240 μl einer Probe enthalten, mit einem zusätzlichen Volumen von 40 μl, um den Pipettierverlust zu berücksichtigen). Laden Sie 120 μl Verdünnungspuffer in alle anderen Vertiefungen auf der Proteinplatte mit geringer Bindung, mit Ausnahme der Spalten 1 und 12 (d. h. B2 bis H11). Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette mit 10 Spitzen eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 120 μl Probe von A2-A11 auf B2-B11 übertragen und mehrmals auf und ab pipettieren, um zu mischen, ohne Spritzer und Blasen zu verursachen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Platte entlang der Säulen bis zu den Vertiefungen H2-H11 hinunterbewegen. Verwerfen Sie das verbleibende Volumen von 120 μl, das aus der letzten Reihe von Vertiefungen abgesaugt wurde.HINWEIS: Die Proben sind jetzt bereit für die Analyse. Wenn die Blockierungsphase zu diesem Zeitpunkt noch nicht abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Proben auf Eis gelegt werden. Waschen Sie die Platten am Ende des Inkubationsschritts dreimal mit 200 μl Waschpuffer. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl Verdünnungspuffer in die Spalten 1 und 12 als “Rohlinge”. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte mit niedrig gebundenem Protein mit Probenverdünnungen auf die gewaschene ELISA-Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle ausgeführten ELISA-Platten. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen Inkubator. Bereiten Sie die Nachweisantikörperlösung (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 0,2 μg/ml vor, indem Sie 4,4 μl der Antikörperlösung zu 10.995,6 μl des Verdünnungsmittelpuffers hinzufügen und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.HINWEIS: Für 96 Wells zu je 100 μl werden insgesamt 11 ml benötigt (mit zusätzlichem Volumen für Pipettierverluste). Erhöhen Sie das Gesamtvolumen um 11 ml für jede weitere ELISA-Platte, die ausgewertet wird. Die Lösung muss sofort nach der Zubereitung verwendet werden. Waschen Sie die Platten am Ende des Inkubationsschritts fünfmal mit 200 μl Waschpuffer. Aspirieren Sie den verbleibenden Waschpuffer und geben Sie 100 μl der Detektionsantikörperlösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung auf der Mikrotiterplatte. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen Inkubator. Bereiten Sie das Konjugat gegen Ende des Inkubationsschritts des Nachweisantikörpers vor, indem Sie 4,4 μl Streptavidin-Peroxidase-Konjugatlösung (siehe Materialtabelle) zu 10.995,6 μl Waschpuffer hinzufügen.HINWEIS: Für 96 Wells zu je 100 μl werden insgesamt 11 ml benötigt (mit zusätzlichem Volumen für das Mehrkanalpipettieren). Erhöhen Sie das Gesamtvolumen um 11 ml für jede weitere ELISA-Platte, die ausgewertet wird. Waschen Sie die Platten fünfmal mit 200 μl Waschpuffer. Aspirieren Sie den verbleibenden Waschpuffer und geben Sie 100 μl der konjugierten Lösung in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen 37 °C heißen Inkubator. Bereiten Sie den Untergrund während des letzten Waschschritts gemäß den Anweisungen des Herstellers vor (siehe Materialtabelle). Lösen Sie für jede Platte eine Tablette o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD; siehe Materialtabelle) in 9 ml deionisiertem Wasser im Dunkeln auf und füllen Sie dann 1 ml 10x stabilen Peroxidpuffer auf. Passen Sie die Anzahl der Tabletten und das Gesamtvolumen der Lösung (10 ml) entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Platten an. Waschen Sie die Platten fünfmal mit 200 μl Waschpuffer. Geben Sie 100 μl des Substrats mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung. Versiegeln Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und lassen Sie sie 10-20 Minuten lichtgeschützt mit Alufolie auf der Bank.HINWEIS: Überwachen Sie die Farbentwicklung visuell, um eine Sättigung zu vermeiden. Geben Sie 50 μl Stopplösung sofort in jede Vertiefung und die Leseplatte, um eine Absorption bei 492 nm und eine Referenzabsorption von 620 nm zu erzielen. Analysieren Sie die Daten anhand des korrigierten Absorptionswerts (Messwert bei 492 nm minus Messwert bei 620 nm) und subtrahieren Sie den Durchschnitt des Blindwerts von allen Proben. Verwenden Sie eine sigmoidale 4PL-Interpolationsmethode, um Absorptionswerte in IU/ml umzuwandeln. Zum Schluss multiplizieren Sie mit den 250 μl (Gesamtprobenvolumen), um sie in IE umzurechnen.HINWEIS: Diese Analyse kann mit einer Datenanalysesoftware durchgeführt werden.