狂犬病抗原を封入した拍動性高分子微粒子の作製

1. パーティクルマスターモールド生成 注意: 3D印刷プロセスは、十分な空間解像度を備えた任意の3Dプリンターで実行できます。ただし、現在のプロトコルは、多光子3Dプリンターのプロセスを記述しています。 コンピュータ支援設計(CAD)プログラムを使用して微粒子構造を設計します。注:設計仕様は次のとおりです:308個の粒子(直径= 400μm、高さ= 500μm、肉厚= 100μm)が22 x 14アレイに配置され、それらの間に600μmの間隔があります。計画には、配列のすぐ外側の基準として4つの尖った星と5つの尖った星も含まれています(補足図1)。 最終デザインをSTLファイル(補足コーディングファイル1)としてエクスポートし、次に示すように印刷パラメータを定義できるソフトウェアにファイルをアップロードします。次に、3Dプリンターと互換性のあるファイルとして保存します( 材料表を参照)。注:スライス距離= 5 μm、ハッチング距離= 1 μm、シェル輪郭= 50 μm、ベーススライス数 = 5 μm、足場=中空、スキャンモード=ガルボ、Z軸=顕微鏡Zドライブ、スキャン速度= 100,000、電力= 100。 プラズマ洗浄プロセス(ガス:O2、電力:200ワット、温度:25°C、流量:20、時間:5分)を使用してシリコン印刷基板(材料表を参照)を前処理し、ガラスシャーレ内のエタノール30 mLとメタクリル酸30 μlの3-(トリメトキシシリル)プロピルの溶液に基板を直ちに浸します。アルミホイルで覆い、一晩インキュベートさせます。注:このステップは、PDMS分離中に重要な基板への印刷接着力を高めます(ステップ2.6)。 印刷ファイルを多光子3Dプリンターにアップロードし、処理された基板に印刷樹脂を塗布し、10倍レンズをロードし( 材料表を参照)、微細構造を印刷します。 終了したら、プリントをプロピレングリコールメチルエーテルアセテート( 材料表を参照)に45分間浸して未露光のフォトレジストを除去し、次にプリントをイソプロピルアルコールに5分間沈めます。マスターモールドを254nmのUV光に120分間さらしてポストキュアします。注:可能な場合は、405〜365nmの範囲のUV光を~20分間使用して、印刷された構造を後硬化させることができます。 2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)モールド生成 3Dプリントされたマスターモールドの表面を、40μLのトリクロロ(1H,1H,2H,2H,-パーフルオロオクチル)シランを表面に添加したスライドガラスを含む真空チャンバーに入れて処理します( 材料の表を参照)。真空を引きます(相対圧力:-20インチ。Hg)を1時間。注意: この手順により、離型時に簡単に分離できます(手順2.6)。 マスターモールド表面が処理されている間に、ポリジメチルシロキサン(PDMS)プレポリマーベースとPDMSプレポリマー硬化剤を9:1の質量比で完全に混合します(マスターモールドごとに少なくとも10 gの材料が必要です)。完全に混合したら、未硬化のPDMSを50 mLの遠沈管に移し、300 x g で室温で3分間遠心分離します。 表面処理が完了したら、マスターモールドをアルミホイル皿に入れ、未硬化のPDMSを金型の上に流し込み、フィーチャーが完全に水没していることを確認します。アルミホイル皿を真空チャンバーに入れ、真空を引きます(相対圧力:-20インチ。Hg)を1時間処理して気泡を除去した。 アルミホイル皿を真空チャンバーから取り出します。マスターモールドの端に800μmのスペーサーを配置し、気泡が発生しないように注意しながら、きれいなスライドガラスをマスターモールドに重ねます。バインダークリップを使用して金型とスライドを一緒にクランプし、スペーサー上のクランプ力を特定します(補足図2)。 構造を120°Cに設定されたオーブンに少なくとも4時間置き、プレポリマーをPDMSモールドに硬化させます。 オーブンから構造を取り外し、バインダークリップを慎重に解放し、かみそりの刃を使用してマスターモールドを硬化PDMSモールドから慎重に分離します。注:3Dプリントされたマスターモールドは、追加のPDMSモールドを生成するために再利用できます。 3. PLGAフィルム製造 450 mgのPLGAを量り( 材料表を参照)、内径50.8 mmの厚さ250 μmのリングシム内の76 mm x 76 mmの焦げ付き防止ポリマーシートに置きます。2枚目の焦げ付き防止ポリマーシートをPLGAの上に置き、101.6 mm cクランプを使用して2つのアルミニウムブロック間のスタックを指で締めるまで圧縮します。注:502H PLGAはこの研究でのみ使用されました。ただし、他のタイプのPLGAはこのプロセスと互換性があります。 cクランプアセンブリを、120°Cに設定された真空オーブンに、相対圧力-30インチHgの真空下で30分間置きます。次に、アセンブリを取り外し、clをしっかりと締めますamp さらに30分間真空オーブンに戻す前に。注意: 真空を使用する主な目的は、高温で加速されるPLGAの劣化を回避することです。 アセンブリをオーブンから取り出し、デシケーターで4時間冷却します。 冷却したら、clを緩めますamps、焦げ付き防止ポリマーシートからPLGAフィルムをはがし、ラベル付きのペトリ皿にフィルムを置きます。後で使用するために、ペトリ皿をデシケーターの中に保管します。 4. PLGA粒子生成 手順 2.1 で前述したように PDMS モールドの表面を処理します。 ピンセットやメスを用いて、250μmのPLGAフィルムの一部(アレイサイズ程度)を切り取り、処理したPDMSモールド上に載せます。 PLGAフィルムとPDMS金型の上にきれいなガラス顕微鏡スライドを重ね、アレイとPLGAフィルムの上にスプリングクランプを直接配置してコンポーネントを一緒にクランプします。 クランプされた金型アセンブリを120°Cに設定された真空オーブンに入れ、相対圧力-30インチで真空を引きます。1時間Hg。注:粒子の形成に必要な時間はPLGAによって異なり、1〜12時間の範囲で変化します。 clを取り出しますampオーブンからモールドアセンブリを取り出し、室温で約15分間、または触ると冷えるまで受動的に冷却します。 かみそりの刃を使用して、PDMSモールドとPLGA粒子アレイの間に静かに圧力を加えて、2つを分離します。PLGA粒子は、将来の使用のためにデシケーターに保管してください。 5. 抗原の濃縮と精製 市販のRABV抗原( 材料表参照)のアリコート1個を室温で解凍する。 分子量カットオフが100 kDaの遠心スピンフィルター(MWCO、 材料表を参照)を2本の収集チューブに入れて、ろ過セットアップを組み立てます。 2つの遠心スピンフィルターを500 μLの超純水を加えてプレウェットします。 フィルターを2,400 x g で室温のベンチトップ遠心分離機で1分間回転させます。 200 μLのピペットを使用して、ろ過セットアップの上部と下部の両方のコンパートメントから水を取り除きます。注意: プリウェットスピンフィルターを乾かさないでください。 各スピンフィルターの上部コンパートメントに400 μLの蒸留水を加え、次に100 μLの解凍したRABV抗原を加えてピペットと混合します。注:この研究では、抗原を約5倍濃縮し、賦形剤の濃度<100 kDaを~50倍減少させました。 2つの遠心スピンフィルターをベンチトップ遠心分離機にロードし、フィルターが遠心分離機の中心を向いていることを確認します。フィルターのどちら側が遠心分離機の中心に向かっているかをマークします。注意: 向きが正しくない場合、溶液は適切にろ過/濃縮されません。 フィルターを14,000 x g で室温で10分間遠心分離します。 遠心分離機からフィルターを取り出します。収集チューブにはろ液が含まれ、フィルターには濃縮サンプルが含まれます(補足図3A)。 ピペットを使用して収集チューブ内の濾液を取り出し、廃棄します。 各フィルターに450 μLのろ過蒸留水を加え、6回上下にピペッティングして濃縮サンプルと水を混合します。 2つのスピンフィルターを14,000 x g で室温で10分間遠心分離します。フィルターが手順5.7と同じ向きで遠心分離機の中心を向いていることを確認します。 遠心分離機からフィルターユニットを取り出し、前と同じように、ピペットを使用して各チューブからろ液を取り出して廃棄します。 収集チューブからスピンフィルターを取り外し、収集チューブの上部を使用してフィルターケーシングにキャップをします(補足図3B)。 スピンフィルターケーシングの底部を渦に直接置き、フィルターケーシングを直立させ、45°の角度で3,000 rpmで35秒間渦巻きます(補足図3C)。注:このステップは、遠心分離プロセス中にペレットを形成したRABV抗原を再懸濁することを目的としています。 スピンフィルターケーシングから収集チューブのキャップを慎重に取り外します。フィルターケーシングを付属の収集チューブに戻し、すばやく回転(2〜3秒)して、キャップに閉じ込められた可能性のあるボリュームを収集します。注意: このクイックスピンは、ベンチトップマイクロ遠心分離機で実行する必要があります。フィルターは、以前の構成とは反対に遠心分離機に接して、フィルターを通して溶液が失われないようにする必要があります。 各スピンフィルターユニットをスピンフィルターキットに付属の新しい収集チューブ( 材料表を参照)に反転させ、室温で1,000 x g で2分間遠心分離して、濃縮されたサンプルを収集します。 2つの収集チューブからの濃縮サンプルを1つの収集チューブに統合します。結果の体積を測定して記録します。注:得られたサンプルは、ストックの初期抗原濃度の5倍、ストックの約50倍低い小さな賦形剤(<100 kDa)濃度を持ち、わずかに乳白色に見えます。総容量は約44〜48μLであるべきです。 5倍濃縮し、2回洗浄した抗原を分注時まで4°Cで16時間以内保存します。この溶液を粒子に充填する前に、チューブを1,000 x g で1分間遠心分離して気泡を取り除きます。溶液は、蒸留水を使用して希釈して、ディスペンシングの公称目標濃度を達成することができます。 6.粒子充填 真空フィルター 0.22 μmの真空フィルターに500 mLの脱イオン水を入れ、次に真空(相対圧力:-20インチ。Hg)を20分間超音波処理しながら。 この間、ピエゾディスペンスキャピラリー(PDC、 材料表を参照)を圧電ディスペンサーに取り付けます。 製造元の指示に従って機械を下塗りし( 材料表を参照)、PLGA粒子の入ったスライドをディスペンスエリアに配置します。 補足図4に従って、「ターゲット基準点の検索」を設定し、実行してから「ターゲット基板」を設定します。 濃縮抗原25 μLをソースプレートにロードし、マシンにロードします。PDCを使用して、濃縮抗原10 μLを分注チップに吸引し、チップの外側を洗浄してから、分注アライメントを校正します(補足図5)。 「ターゲット設定パラメータ」を入力し、[実行]をクリックします(補足図6)。 完了したら、充填された粒子を取り除き、ステレオスコープで充填されていることを確認します。 プロトコルの次のステップに直接移動します。 7. 粒子のシーリングとハーベスティング ステンレス鋼ブロック( 材料表を参照)をホットプレートに置きます。2枚の顕微鏡スライドをステンレス鋼ブロックの上に置き、平行になるようにします。ステンレス鋼ブロックが水平であることを確認してから、ホットプレートをオンにして、ステンレス鋼の表面温度が200°Cになるように温度を設定します。 密封する前に、ホットプレートの温度を確認してください。 充填されたPLGA粒子を2つのスライドガラスの上に置いてホットプレートの上に吊り下げ、すぐにタイマーを18秒間開始します。注意: 粒子を密封するために必要な時間と熱の量は、粒子の製造に使用されるPLGAの化学的特性によって異なります。カスタム3Dプリントスライドホルダーを使用して、ホットプレートから安全な距離でスライドを取り扱うことができます。STLファイルは、 補足コーディングファイル2として提供されます。 密閉したら、ホットプレートからパーティクルアレイを取り出し、パーティクルアレイを2つの別々のスライドガラスに配置してラボベンチに吊り下げます。粒子を1分間冷まします。 冷却されると、ステレオスコープを覗きながらメスを使用して粒子を採取できます。スライドに対して45°の角度でブレードでメスを保持し、粒子のベースに圧力を加えてスライドガラスから分離します。 採取したら、メスを使用して粒子を0.5 mLの低タンパク質結合チューブに移します( 材料表を参照)。次に、30 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)と1 mg/mLグルコースを含む250 μLの1xリン酸緩衝液(PBS)をチューブに充填します。注:PBSで調製した30 mg/mL BSAおよび1 mg/mLグルコース溶液は、RABV抗原の安定性を維持します。 ピンセットを使用してステレオスコープの下で粒子を粉砕します。粒子のコアにあるRABV抗原が周囲の溶液に溶解できることを確認してください。ELISAを使用して抗原効力を評価できるようになるまで、サンプルを4°Cの冷蔵庫に保管します。サンプルは、調製から7日以内にELSIAで分析する必要があります。 8. ELISAによる抗原の評価 注意: マイクロプレートを乾燥させないでください。常にプレートを積み重ね、乾燥しないように常に上部プレートをプラスチックシール、空のプレート、または蓋で覆ってください。 補足ファイル 1 の指示に従ってバッファーを準備します。 pH 9.4-9.6のコーティングバッファー4975 μLにコーティング抗体25 μLを添加し、2.5 μg/mLの濃度のコーティング溶液(炭酸水素塩緩衝液、pH 9.6)5 mLを調製します。注:96ウェルをそれぞれ50 μLでコーティングするには、5 mLが必要です(ピペッティング損失のために余分な容量があります)。必要なELISAプレートを追加するたびに、総容量を5 mLずつ増やします。 マルチチャンネルピペットを使用して、50 μLのコーティング溶液をマイクロプレートの各ウェルに分注します。溶液は、調製後すぐにコーティングに使用する必要があります。 手袋をはめた手のひらのプレートの端に沿って軽くたたいて、各ウェルの底が液体で均等に覆われていることを確認します。 プレートを粘着フィルムで密封し、37°Cで1時間置いた後、4°Cに一晩移します。 プレートを冷蔵倉庫から取り出し、各ウェルで200 μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。 洗浄バッファーを取り外し、300 μLのブロッキングバッファーを各ウェルに分注します。注意: 同じサンプルを異なるプレートで繰り返して複数のプレートを実行する場合は、プレートごとに進めることが重要です(つまり、プレート1に材料を充填してからプレート2に進み、次にプレート3に進みます)。材料Xをすべてのプレートに適用してから材料Yなどを適用すると、ウェルが乾燥するリスクが高まるため、適用しないでください。最後の洗浄ステップの後、洗浄バッファーはプレートのウェルに残し、サンプルをプレートに追加する直前にのみ廃棄する必要があります。プラスチック製の96ウェルプレート蓋を使用して、すぐに分注されていないELISAプレートのすべてのウェルを覆う必要があり、蓋を順次動かして、材料で満たされる追加のウェルを明らかにします。 プレートを粘着プラスチックフィルム( 材料表を参照)で密封し、インキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。 このインキュベーション中に評価する標準曲線とテストサンプルを準備します。注:評価対象の抗原は、ピペッティング損失を考慮して、0.125 IU/mLの推奨希釈で希釈バッファーで事前に希釈し、少なくとも40 μLの過剰容量で希釈する必要があります。すべてのサンプルは、各ELISAプレート上で重複して(2回のテクニカルレプリケート)評価されます。検量線の場合、各ELISAプレートのカラム2と3に合計8ポイントの2倍希釈系列を含める必要があります。希釈シリーズは、評価される抗原の予測量に基づいて適切なポイント数を有する他のすべてのサンプルに対して実行され得る。スループットを高めるための厳密さは劣りますが、上記のめっきの代替として、単一のサンプル希釈を使用できます。ただし、単一希釈の予想濃度は標準曲線範囲内に収まる必要があります。 低結合タンパク質96ウェルプレート、または低結合タンパク質チューブ( 材料表参照)で、プレートのカラムに沿って各サンプルの2倍希釈シリーズを実行します。 各サンプルのA列に希釈シリーズの開始を、必要な最終容量の2倍でロードします(プレートあたり、ウェルあたり100 μLのサンプルが必要であるため、A2-A11のすべてのウェルには少なくとも240 μLのサンプルが含まれ、ピペッティング損失を考慮して40 μLの追加容量が必要です)。 120 μLの希釈バッファーを、カラム1および12(B2からH11)を除く低結合タンパク質プレート上の他のすべてのウェルにロードします。 10個のチップを装着したマルチチャンネルピペットを使用して、120 μLのサンプルをA2-A11からB2-B11に移し、数回上下にピペッティングして、飛沫や気泡を避けながら混合することで、段階希釈を行います。このプロセスを繰り返し、ウェルH2-H11までカラムに沿ってプレートを下に移動します。最後の列のウェルから吸引した残りの120 μL容量を廃棄します。注:これで、サンプルを分析する準備が整いました。この時点までにブロッキングフェーズが完了していない場合は、サンプルが氷上に保管されていることを確認してください。 インキュベーションステップの最後に、200 μLの洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。 マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの希釈バッファーを「ブランク」としてカラム1および12に移します。 マルチチャンネルピペットを用いて、サンプル希釈液を含む低結合タンパク質96ウェルプレートの各ウェルから100 μLを洗浄したELISAプレートに移します。実行するすべてのELISAプレートについて繰り返します。 プレートを粘着性プラスチックフィルムで密封し、インキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。 10,995.6 μLの希釈バッファーに4.4 μLの抗体溶液を加えて0.2 μg/mLの濃度の検出抗体溶液( 材料表参照)を調製し、上下にピペッティングしてよく混合します。注:96ウェルにそれぞれ100 μLで合計11 mLが必要です(ピペッティング損失のために余分な容量があります)。評価するELISAプレートを追加するたびに、総容量を11 mLずつ増やします。溶液は調製直後に使用しなければならない。 インキュベーションステップの最後に、200 μLの洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。 残りの洗浄バッファーを吸引し、マルチチャンネルピペットを使用して100 μLの検出抗体溶液をマイクロプレート上の各ウェルに分注します。 プレートを粘着性プラスチックフィルムで密封し、インキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。 検出抗体インキュベーションステップの終わりに向けて、4.4 μLのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲート溶液( 材料の表を参照)を10,995.6 μLの洗浄バッファーに添加してコンジュゲートを調製します。注:96 ウェル、それぞれ 100 μL には合計 11 mL が必要です (マルチチャンネルピペッティング用に容量を増やします)。評価するELISAプレートを追加するたびに、総容量を11 mLずつ増やします。 プレートを200 μLの洗浄バッファーで5回洗浄します。 残りの洗浄バッファーを吸引し、コンジュゲート溶液100 μLを各ウェルに分注します。 プレートを粘着性プラスチックフィルムで密封し、37°Cのインキュベーターに37±2°Cで60±5分間置きます。 製造元の指示に従って、最終洗浄ステップ中に基板を準備します( 材料表を参照)。各プレートについて、1錠のo-フェニレンジアミン二塩酸塩(OPD; 材料表を参照)を暗所で9 mLの脱イオン水に溶解し、1 mLの10倍安定過酸化物バッファーを補充します。評価するプレートの数に応じて、錠剤の数と溶液の総量(10 mL)を調整します。 プレートを200 μLの洗浄バッファーで5回洗浄します。 マルチチャンネルピペットを使用して100 μLの基質を各ウェルに分注します。 プレートを粘着プラスチックフィルムで密封し、アルミホイルを使用して光から保護された10〜20分間ベンチに置いておきます。注意: 彩度を避けるために、発色を視覚的に監視します。 50 μLの停止溶液を各ウェルとリードプレートに直ちに加え、492 nmでの吸光度と620 nmの参照吸光度を確認します。 補正された吸光度の読み取り値(492 nmでの読み取り値から620 nmでの読み取り値を引いた値)を使用してデータを分析し、すべてのサンプルからブランクの平均を引きます。シグモイド4PL補間法を使用して、吸光度値をIU / mLに変換します。最後に、250 μL(総サンプル量)を掛けてIUに変換します。注:この分析は、データ分析ソフトウェアを使用して実行できます。