Flow Sitometride Bacillus subtilis Spor Sayımı ve Etiket Analizinin İyileştirilmesi
Summary
Bu protokol, etidyum bromür ile etiketlenmiş bakteri sporlarını ölçmek için akış sitometrisinin kullanımına ve boncuk saymaya odaklanır. Yöntem ayrıca, bozulmamış sporların yüzeyindeki proteinlerin kovalent bağlanmasını analiz etmek için de etkilidir.
Abstract
Bacillus subtilis’in sporları, farklı biyoteknolojik ve immünolojik uygulamalar için zaten önerilmiştir; Bununla birlikte, sporların yüzeyinde hareketsiz hale getirilen antijenlerin miktar tayinleri ile birlikte tespitini iyileştiren metodolojilerin geliştirilmesine artan bir ihtiyaç vardır. Akış sitometrisine dayalı analizler daha önce B. subtilis’in etiketli hücrelerini tespit etmek için hızlı, güvenilir ve spesifik yaklaşımlar olarak önerilmiştir. Burada, sporun yüzeyindeki bir floresan antikorun (FA) görüntüleme verimliliğini değerlendirmek ve sayma boncukları kullanarak spor sayısını ölçmek için akış sitometrisinin kullanılmasını öneriyoruz.
Bunun için DNA markörü olarak etidyum bromür ve yüzey markörü olarak sporlara bağlı allofikosiyanin (APC) etiketli antikor kullandık. Sporların miktarının belirlenmesi, sayma boncukları kullanılarak gerçekleştirildi, çünkü bu teknik hücrelerin tespitinde yüksek doğruluk gösteriyor. Etiketli sporlar, eşleşmeyi doğrulayan bir akış sitometresi kullanılarak analiz edildi. Sonuç olarak, DNA etiketlemesinin, çimlenmiş sporların tespiti için akış sitometrisi ile miktar tayininin doğruluğunu geliştirdiği gösterilmiştir. Etidyum bromürün hareketsiz sporları etiketleyemediği gözlemlendi; Bununla birlikte, bu teknik, yüzeylerine bağlı floresan proteini ile sporların sayısının daha kesin bir şekilde belirlenmesini sağlar, böylece sporların farklı uygulamalarda biyoteknolojik bir platform olarak kullanımına odaklanan çalışmaların geliştirilmesine yardımcı olur.
Introduction
Bacillus subtilis, çevresel koşullar hücre büyümesine izin vermediğinde hareketsiz sporlar üretebilen, çubuk şeklinde, gram pozitif bir bakteridir1. Sporlar son derece kararlı hücre formlarıdır ve B. subtilis de dahil olmak üzere çeşitli türlerin sporları, insan ve hayvan kullanımı için probiyotik olarak yaygın olarak kullanılmaktadır2. Direnç ve güvenlik özellikleri nedeniyle, heterolog proteinler sergileyen B. subtilis sporu, bir mukozal adjuvan, bir aşı dağıtım sistemi ve bir enzim immobilizasyon platformu olarak önerilmiştir 3,4.
B. subtilis’ten spor elde etmek için, özel bir kültür ortamı kullanarak besin yoksunluğuna maruz bırakmak gerekir. Bu sporları elde ettikten ve saflaştırdıktan sonra, test verimliliğini artırmak için bunları ölçmek gerekir 5,6. Bu nedenle, elde edilen sporların konsantrasyonunu analiz etmek için belirli yöntemler uygulanır. Plaka sayma ve sayma odası olarak da bilinen Petroff-Hausser odası kullanılabilir. İkincisi başlangıçta kan hücrelerinin konsantrasyonunu belirlemek için geliştirilmiştir; Ancak mikrobiyoloji alanında spor sayımı için kullanmak mümkündür 7,8. Hücre sayımı için kullanılan standart yöntem olmasına rağmen, bu yöntem tamamen manuel olduğundan ve doğruluğu operatörün deneyimine bağlı olduğundan okuma zahmetlidir.
Akış sitometrisi tabanlı (FC) analizler daha önce Bacillus spp.’nin etiketli hücrelerini tespit etmek için hızlı, güvenilir ve spesifik yaklaşımlar olarak önerilmiştir. Akış sitometrisi sayım boncuklarının kullanımı, rutin muayenelerde (CD4 ve CD8 T lenfositlerinin mutlak sayımı) hücre sayımında ve akış sitometrisi9 kullanılarak tespit edilebilen ve sayılabilen partikülleri içeren araştırmaların geliştirilmesinde tekrarlanabilirliği garanti etmiştir. Godjafrey ve Alsharif, etiketlenmemiş sporların FC miktar tayini için sayma boncuklarının kullanılmasını önerdi10. Bacillus spp.‘de sporülasyonun izlenmesi için akım sitometrisinin kullanımı tanımlanmıştır.spor DNA’sınıetiketleyerek 10,11,12,13. Yine başka bir çalışma, spor yüzeyindeki floresan etiketli proteinlerin miktarını değerlendirmek için FC’yi kullandı15.
Bu çalışma, akış sitometrisi kullanılarak olay sayımına göre bir tekrarlanabilirlik standardı sağlamak için ticari sayma boncuklarını kullanmayı amaçlamıştır. Burada, spor sayımını iyileştirmek ve spor yüzeyindeki floresan etiketli antikorların bağlanma verimliliğini değerlendirmek için FC’de hücre sayımı için sayma boncuklarının kullanılmasını öneriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kolonilerin plaka sayımı gibi geleneksel yöntemler sadece zaman alıcı olmakla kalmaz, aynı zamanda canlı hücrelere ihtiyaç duyar ve inaktive edilmiş sporların miktarının belirlenmesine izin vermez5. Petroff-Hausser odası alternatif bir metodolojidir, ancak bunu gerçekleştirmek için deneyimli bir mikroskopist gerektirir. Akış sitometrisinin bu amaç için yararlı bir alternatif olduğu kanıtlanmıştır.
Genovese ve ark.12 , <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 tarafından finanse edilmiştir; Governo do Estado do Amazonas, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM’ın kaynaklarıyla Amazonas; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Yazarlar, Sağlık Araçlarında Teknolojik Gelişme Programı’na tesislerinin kullanımı için PDTIS-FIOCRUZ’a teşekkür eder.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
