Mejora de la enumeración de esporas de Bacillus subtilis y el análisis de etiquetas en citometría de flujo
Summary
Este protocolo se centra en el uso de citometría de flujo y perlas de recuento para cuantificar las esporas bacterianas marcadas con bromuro de etidio. El método también es eficiente para analizar el acoplamiento covalente de proteínas en la superficie de esporas intactas.
Abstract
Las esporas de Bacillus subtilis ya han sido propuestas para diferentes aplicaciones biotecnológicas e inmunológicas; Sin embargo, cada vez es más necesario desarrollar metodologías que mejoren la detección de antígenos inmovilizados en la superficie de las esporas junto con su cuantificación. Los análisis basados en citometría de flujo se han propuesto previamente como enfoques rápidos, fiables y específicos para detectar células marcadas de B. subtilis. En este trabajo, proponemos el uso de la citometría de flujo para evaluar la eficiencia de visualización de un anticuerpo fluorescente (AF) en la superficie de la espora y cuantificar el número de esporas mediante perlas de recuento.
Para ello, utilizamos bromuro de etidio como marcador de ADN y un anticuerpo marcado con aloficocianina (APC), que se acopló a las esporas, como marcador de superficie. La cuantificación de las esporas se realizó mediante perlas de conteo, ya que esta técnica demuestra una alta precisión en la detección de células. Las esporas marcadas se analizaron con un citómetro de flujo, lo que confirmó el acoplamiento. Como resultado, se demostró que el marcaje de ADN mejoró la precisión de la cuantificación por citometría de flujo, para la detección de esporas germinadas. Se observó que el bromuro de etidio no era capaz de marcar las esporas latentes; Sin embargo, esta técnica proporciona una determinación más precisa del número de esporas con proteína fluorescente acoplada a su superficie, lo que ayuda en el desarrollo de estudios que se centran en el uso de esporas como plataforma biotecnológica en diferentes aplicaciones.
Introduction
Bacillus subtilis es una bacteria grampositiva en forma de bastoncillo que es capaz de producir esporas quiescentes cuando las condiciones ambientales no permiten el crecimiento celular1. Las esporas son formas celulares extremadamente estables y las de varias especies, incluida B. subtilis, se utilizan ampliamente como probióticos para uso humano y animal2. Debido a sus propiedades de resistencia y seguridad, la espora de B. subtilis, que presenta proteínas heterólogas, ha sido propuesta como adyuvante de la mucosa, sistema de administración de vacunas y plataforma de inmovilización enzimática 3,4.
Para obtener esporas de B. subtilis, es necesario exponerlo a la privación de nutrientes utilizando un medio de cultivo especial. Después de obtener y purificar estas esporas, se deben cuantificar para mejorar la eficiencia de la prueba 5,6. Así, se aplican ciertos métodos para analizar la concentración de las esporas obtenidas. Se puede utilizar el conteo de placas y una cámara de Petroff-Hausser, también conocida como cámara de conteo. Este último se desarrolló originalmente para determinar la concentración de células sanguíneas; sin embargo, es posible utilizarlo en el campo de la microbiología para el recuento de esporas 7,8. A pesar de ser el método estándar utilizado para el conteo de células, la lectura es laboriosa ya que este método es completamente manual y su precisión depende de la experiencia del operador.
Los análisis basados en citometría de flujo (FC) se han propuesto previamente como enfoques rápidos, confiables y específicos para detectar células marcadas de Bacillus spp. El uso de perlas de recuento por citometría de flujo ha garantizado la reproducibilidad en el recuento celular, en los exámenes rutinarios (recuento absoluto de linfocitos T CD4 y CD8) y en el desarrollo de investigaciones con partículas capaces de ser detectadas y contadas mediante citometría de flujo9. Godjafrey y Alsharif sugirieron el uso de perlas de conteo para la cuantificación de FC de esporas no marcadas10. Se describió el uso de citometría de flujo para el monitoreo de la esporulación en Bacillus spp. a través del marcaje del ADN de las esporas 10,11,12,13. Otro estudio utilizó FC para evaluar la cantidad de proteínas marcadas con fluorescencia en la superficie de las esporas15.
Este estudio buscó utilizar perlas de conteo comerciales para asegurar un estándar de reproducibilidad con respecto al conteo de eventos mediante citometría de flujo. En este artículo, sugerimos el uso de perlas de recuento para el recuento de células en FC para refinar la enumeración de esporas y evaluar la eficiencia de acoplamiento de anticuerpos marcados con fluorescencia en la superficie de las esporas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos tradicionales, como el recuento en placa de las colonias, no solo consumen mucho tiempo, sino que también necesitan células viables y no permiten la cuantificación de esporas inactivadas5. La cámara de Petroff-Hausser es una metodología alternativa, pero requiere de un microscopista experimentado para realizarla. La citometría de flujo ha demostrado ser una alternativa útil para este propósito.
Genovese et al.12 describieron …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código de Finanzas 001; Governo do Estado do Amazonas con recursos de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq). Los autores agradecen al Programa de Desarrollo Tecnológico en Herramientas para la Salud PDTIS-FIOCRUZ por el uso de sus instalaciones.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
