Summary

Miglioramento dell'enumerazione delle spore di Bacillus subtilis e analisi dell'etichetta nella citometria a flusso

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo si concentra sull’uso della citometria a flusso e del conteggio delle microsfere per quantificare le spore batteriche marcate con bromuro di etidio. Il metodo è anche efficiente per analizzare l’accoppiamento covalente di proteine sulla superficie di spore intatte.

Abstract

Le spore di Bacillus subtilis sono già state proposte per diverse applicazioni biotecnologiche ed immunologiche; Tuttavia, vi è una crescente necessità di sviluppare metodologie che migliorino la rilevazione degli antigeni immobilizzati sulla superficie delle spore insieme alla loro quantificazione. Le analisi basate sulla citometria a flusso sono state precedentemente proposte come approcci veloci, affidabili e specifici per la rilevazione di cellule marcate di B. subtilis. In questo articolo, proponiamo l’uso della citometria a flusso per valutare l’efficienza di visualizzazione di un anticorpo fluorescente (FA) sulla superficie della spora e quantificare il numero di spore utilizzando le perle di conteggio.

Per questo, abbiamo usato il bromuro di etidio come marcatore del DNA e un anticorpo marcato con alloficocianina (APC), che è stato accoppiato alle spore, come marcatore di superficie. La quantificazione delle spore è stata eseguita utilizzando le perle di conteggio poiché questa tecnica dimostra un’elevata precisione nel rilevamento delle cellule. Le spore marcate sono state analizzate utilizzando un citometro a flusso, che ha confermato l’accoppiamento. Di conseguenza, è stato dimostrato che la marcatura del DNA ha migliorato l’accuratezza della quantificazione mediante citometria a flusso, per la rilevazione delle spore germinate. È stato osservato che il bromuro di etidio non era in grado di marcare le spore dormienti; Tuttavia, questa tecnica fornisce una determinazione più precisa del numero di spore con proteina fluorescente accoppiata alla loro superficie, aiutando così nello sviluppo di studi che si concentrano sull’uso delle spore come piattaforma biotecnologica in diverse applicazioni.

Introduction

Il Bacillus subtilis è un batterio gram-positivo a forma di bastoncino in grado di produrre spore quiescenti quando le condizioni ambientali non consentono la crescita cellulare1. Le spore sono forme cellulari estremamente stabili e quelle di diverse specie, tra cui B. subtilis, sono ampiamente utilizzate come probiotici per uso umano e animale2. Grazie alle sue proprietà di resistenza e sicurezza, la spora di B. subtilis, che presenta proteine eterologhe, è stata proposta come adiuvante della mucosa, sistema di somministrazione di vaccini e piattaforma di immobilizzazione enzimatica 3,4.

Per ottenere spore da B. subtilis, è necessario esporlo alla privazione di nutrienti utilizzando uno speciale terreno di coltura. Dopo aver ottenuto e purificato queste spore, è necessario quantificarle per migliorare l’efficienza del test 5,6. Pertanto, vengono applicati alcuni metodi per analizzare la concentrazione delle spore ottenute. È possibile utilizzare il conteggio delle piastre e una camera Petroff-Hausser, nota anche come camera di conteggio. Quest’ultimo è stato originariamente sviluppato per determinare la concentrazione delle cellule del sangue; tuttavia, è possibile utilizzarlo nel campo della microbiologia per il conteggio delle spore 7,8. Nonostante sia il metodo standard utilizzato per il conteggio delle cellule, la lettura è laboriosa poiché questo metodo è completamente manuale e la sua precisione dipende dall’esperienza dell’operatore.

Le analisi basate sulla citometria a flusso (FC) sono state precedentemente proposte come approcci veloci, affidabili e specifici per rilevare cellule marcate di Bacillus spp. L’uso di microsfere di conteggio con citometria a flusso ha garantito la riproducibilità nella conta cellulare negli esami di routine (conta assoluta dei linfociti T CD4 e CD8) e nello sviluppo della ricerca che coinvolge particelle in grado di essere rilevate e contate utilizzando la citometria a flusso9. Godjafrey e Alsharif hanno suggerito l’uso di perline di conteggio per la quantificazione FC di spore non marcate10. L’uso della citometria a flusso è stato descritto per il monitoraggio della sporulazione in Bacillus spp. tramite l’etichettatura del DNA delle spore 10,11,12,13. Un altro studio ha utilizzato FC per valutare la quantità di proteine marcate in modo fluorescente sulla superficie delle spore15.

Questo studio ha cercato di utilizzare perle di conteggio commerciali per garantire uno standard di riproducibilità rispetto al conteggio degli eventi utilizzando la citometria a flusso. In questo articolo, suggeriamo l’uso di perline di conteggio per il conteggio delle cellule in FC per perfezionare l’enumerazione delle spore e valutare l’efficienza di accoppiamento di anticorpi marcati con fluorescenza sulla superficie delle spore.

Protocol

Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e il software utilizzati in questo protocollo. 1. Impostazione della citometria a flusso Allineamento dei parametri ottici di un citometro a flusso accoppiato ad un computerAccedere al software del citometro. Dall’area di lavoro del software, selezionare Citometro | Avviare e attendere qualche minuto | Modalità di pu…

Representative Results

Nei campioni di spore autoclavate (AS), sono state rilevate rispettivamente 2 × 103 spore/μl e 1 ×10 3 spore/μl utilizzando le microsfere di conteggio e il metodo Petroff-Hausser (Figura 2). Figura 1: Schema generale di quantificazione delle spore. (A) spore marcate …

Discussion

I metodi tradizionali, come il conteggio su piastra delle colonie, non solo richiedono molto tempo, ma richiedono anche cellule vitali e non consentono la quantificazione delle spore inattivate5. La camera di Petroff-Hausser è una metodologia alternativa, ma richiede un microscopista esperto per eseguirla. La citometria a flusso si è dimostrata un’utile alternativa a questo scopo.

Genovese et al.12 hanno descritto l’uso della citometria a fluss…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Codice finanziario 001; Governo do Estado do Amazonas con risorse della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Gli autori ringraziano il Programma per lo Sviluppo Tecnologico in Strumenti per la Salute PDTIS-FIOCRUZ per l’uso delle sue strutture.

Materials

((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) Sigma 341006
(N-hydroxysuccinimide) (NHS) Sigma 130672
Anti-human fluorescent antibody BioLegend 501410 APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody Thermo Scientific A32723 Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II  BD Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) BD 642412 Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3 BD 643629 Software
Centrifuge MegaFuge 8R Thermo Scientific 75007213
Counting Beads BD 340334 TruCount Tubes
Eclipse 80i Nikon Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich A4503
Plastic Microtubes Eppendorf
Polystyrene tube Falcon 352008 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile

References

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Alves, K. C., Chaves, Y. O., Almeida, M. E., Vasconcelos, M. G., Nogueira, P. A., Melo, J., Marques, J., Zuliani, J. P., Boeno, C. N., Paloschi, M. V., Isticato, R., Ricca, E., Mariúba, L. A. Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (196), e65141, doi:10.3791/65141 (2023).

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