Summary

تحسين تعداد بوغ العصوية الرقيقة وتحليل التسمية في قياس التدفق الخلوي

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

يركز هذا البروتوكول على استخدام قياس التدفق الخلوي وعد الخرز لتحديد الجراثيم البكتيرية الموسومة ببروميد الإيثيديوم. هذه الطريقة فعالة أيضا لتحليل الاقتران التساهمي للبروتينات على سطح الجراثيم السليمة.

Abstract

وقد تم بالفعل اقتراح جراثيم Bacillus subtilis لمختلف تطبيقات التكنولوجيا الحيوية والمناعة. ومع ذلك ، هناك حاجة متزايدة لتطوير منهجيات تعمل على تحسين الكشف عن المستضدات التي تجمد على سطح الجراثيم جنبا إلى جنب مع قياسها الكمي. تم اقتراح التحليلات القائمة على قياس التدفق الخلوي سابقا كنهج سريعة وموثوقة ومحددة للكشف عن الخلايا الموسومة من B. subtilis. هنا ، نقترح استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة عرض الجسم المضاد الفلوري (FA) على سطح البوغ وتحديد عدد الجراثيم باستخدام عد الخرز.

لهذا ، استخدمنا بروميد الإيثيديوم كعلامة للحمض النووي وجسم مضاد يحمل علامة allophycocyanin (APC) ، والذي كان مقترنا بالجراثيم ، كعلامة سطحية. تم إجراء القياس الكمي للجراثيم باستخدام عد الخرز لأن هذه التقنية توضح دقة عالية في الكشف عن الخلايا. تم تحليل الجراثيم الموسومة باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، والذي أكد الاقتران. نتيجة لذلك ، ثبت أن وضع العلامات على الحمض النووي يحسن دقة القياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي ، للكشف عن الجراثيم النابتة. ولوحظ أن بروميد الإيثيديوم غير قادر على تسمية الجراثيم الخاملة؛ ومع ذلك ، توفر هذه التقنية تحديدا أكثر دقة لعدد الجراثيم التي تحتوي على بروتين فلوري مقترن بسطحها ، مما يساعد في تطوير الدراسات التي تركز على استخدام الجراثيم كمنصة للتكنولوجيا الحيوية في تطبيقات مختلفة.

Introduction

Bacillus subtilis هي بكتيريا إيجابية الجرام على شكل قضيب قادرة على إنتاج جراثيم هادئة عندما لا تسمح الظروف البيئية بنمو الخلايا1. الجراثيم هي أشكال خلايا مستقرة للغاية وتستخدم تلك الخاصة بالعديد من الأنواع ، بما في ذلك B. subtilis ، على نطاق واسع كبروبيوتيك للاستخدام البشري والحيواني2. نظرا لمقاومتها وخصائص سلامتها ، تم اقتراح بوغ B. subtilis ، الذي يعرض بروتينات غير متجانسة ، كمساعد مخاطي ، ونظام توصيل لقاح ، ومنصة تثبيت الإنزيم 3,4.

للحصول على جراثيم من B. subtilis ، من الضروري تعريضها للحرمان من المغذيات باستخدام وسيط ثقافة خاص. بعد الحصول على هذه الجراثيم وتنقيتها ، يجب على المرء تحديدها كميا لتحسين كفاءة الاختبار 5,6. وبالتالي ، يتم تطبيق طرق معينة لتحليل تركيز الجراثيم التي تم الحصول عليها. يمكن استخدام عد الألواح وغرفة Petroff-Hausser ، والمعروفة أيضا باسم غرفة العد. تم تطوير هذا الأخير في الأصل لتحديد تركيز خلايا الدم. ومع ذلك ، فمن الممكن استخدامه في مجال علم الأحياء الدقيقة لعد الأبواغ 7,8. على الرغم من كونها الطريقة القياسية المستخدمة في عد الخلايا ، إلا أن القراءة شاقة لأن هذه الطريقة يدوية تماما وتعتمد دقتها على خبرة المشغل.

تم اقتراح التحليلات القائمة على قياس التدفق الخلوي (FC) سابقا كنهج سريعة وموثوقة ومحددة للكشف عن الخلايا الموسومة ل Bacillus spp. يضمن استخدام حبات عد التدفق الخلوي قابلية التكاثر في عد الخلايا في الفحوصات الروتينية (العدد المطلق للخلايا الليمفاوية CD4 و CD8 T) وفي تطوير الأبحاث التي تتضمن جزيئات يمكن اكتشافها وحسابها باستخدام قياس التدفقالخلوي 9. اقترح جودجافري والشريف استخدام عد الخرز لتحديد كمية FC للجراثيم غير الموسومة10. تم وصف استخدام قياس التدفق الخلوي لرصد التبويض في Bacillus spp. عن طريق وضع علامات على الحمض النووي للجراثيم10،11،12،13. ومع ذلك ، استخدمت دراسة أخرى FC لتقييم كمية البروتينات الموسومة بالفلورسنت على سطح البوغ15.

سعت هذه الدراسة إلى استخدام حبات العد التجارية لضمان معيار من التكاثر فيما يتعلق بحساب الأحداث باستخدام قياس التدفق الخلوي. هنا ، نقترح استخدام عد حبات عد الخلايا في FC لتحسين تعداد الأبواغ وتقييم كفاءة اقتران الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية على سطح البوغ.

Protocol

راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول. 1. إعداد قياس التدفق الخلوي محاذاة المعلمات البصرية لمقياس التدفق الخلوي المقترن بجهاز كمبيوترقم بتسجيل الدخول إلى برنامج Cytometer. من…

Representative Results

في عينات البوغ المعقمة (AS) ، تم الكشف عن 2 × 103 جراثيم / ميكرولتر و 1 × 103 جراثيم / ميكرولتر باستخدام عد الخرز وطريقة بتروف-هوسر ، على التوالي (الشكل 2). الشكل 1: المخط?…

Discussion

الطرق التقليدية ، مثل عد لوحات المستعمرات ، لا تستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل تحتاج أيضا إلى خلايا قابلة للحياة ولا تسمح بقياس كمية الجراثيم المعطلة5. غرفة بتروف-هوسر هي منهجية بديلة ، لكنها تتطلب مجهريا متمرسا لتنفيذها. أثبت قياس التدفق الخلوي أنه بديل مفيد لهذا الغرض.

<p class="jove…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) – قانون المالية 001. Governo do Estado do Amazonas بموارد من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq). يشكر المؤلفون برنامج التطوير التكنولوجي في أدوات الصحة PDTIS-FIOCRUZ على استخدام مرافقه.

Materials

((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) Sigma 341006
(N-hydroxysuccinimide) (NHS) Sigma 130672
Anti-human fluorescent antibody BioLegend 501410 APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody Thermo Scientific A32723 Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II  BD Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) BD 642412 Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3 BD 643629 Software
Centrifuge MegaFuge 8R Thermo Scientific 75007213
Counting Beads BD 340334 TruCount Tubes
Eclipse 80i Nikon Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich A4503
Plastic Microtubes Eppendorf
Polystyrene tube Falcon 352008 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile

References

  1. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
  2. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
  3. Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
  4. Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
  5. Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
  6. Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
  7. Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
  8. Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
  9. Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
  10. Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
  11. Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
  12. Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
  13. Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
  14. Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
  15. Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
  16. Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).

Play Video

Cite This Article
Alves, K. C., Chaves, Y. O., Almeida, M. E., Vasconcelos, M. G., Nogueira, P. A., Melo, J., Marques, J., Zuliani, J. P., Boeno, C. N., Paloschi, M. V., Isticato, R., Ricca, E., Mariúba, L. A. Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (196), e65141, doi:10.3791/65141 (2023).

View Video