يركز هذا البروتوكول على استخدام قياس التدفق الخلوي وعد الخرز لتحديد الجراثيم البكتيرية الموسومة ببروميد الإيثيديوم. هذه الطريقة فعالة أيضا لتحليل الاقتران التساهمي للبروتينات على سطح الجراثيم السليمة.
وقد تم بالفعل اقتراح جراثيم Bacillus subtilis لمختلف تطبيقات التكنولوجيا الحيوية والمناعة. ومع ذلك ، هناك حاجة متزايدة لتطوير منهجيات تعمل على تحسين الكشف عن المستضدات التي تجمد على سطح الجراثيم جنبا إلى جنب مع قياسها الكمي. تم اقتراح التحليلات القائمة على قياس التدفق الخلوي سابقا كنهج سريعة وموثوقة ومحددة للكشف عن الخلايا الموسومة من B. subtilis. هنا ، نقترح استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة عرض الجسم المضاد الفلوري (FA) على سطح البوغ وتحديد عدد الجراثيم باستخدام عد الخرز.
لهذا ، استخدمنا بروميد الإيثيديوم كعلامة للحمض النووي وجسم مضاد يحمل علامة allophycocyanin (APC) ، والذي كان مقترنا بالجراثيم ، كعلامة سطحية. تم إجراء القياس الكمي للجراثيم باستخدام عد الخرز لأن هذه التقنية توضح دقة عالية في الكشف عن الخلايا. تم تحليل الجراثيم الموسومة باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، والذي أكد الاقتران. نتيجة لذلك ، ثبت أن وضع العلامات على الحمض النووي يحسن دقة القياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي ، للكشف عن الجراثيم النابتة. ولوحظ أن بروميد الإيثيديوم غير قادر على تسمية الجراثيم الخاملة؛ ومع ذلك ، توفر هذه التقنية تحديدا أكثر دقة لعدد الجراثيم التي تحتوي على بروتين فلوري مقترن بسطحها ، مما يساعد في تطوير الدراسات التي تركز على استخدام الجراثيم كمنصة للتكنولوجيا الحيوية في تطبيقات مختلفة.
Bacillus subtilis هي بكتيريا إيجابية الجرام على شكل قضيب قادرة على إنتاج جراثيم هادئة عندما لا تسمح الظروف البيئية بنمو الخلايا1. الجراثيم هي أشكال خلايا مستقرة للغاية وتستخدم تلك الخاصة بالعديد من الأنواع ، بما في ذلك B. subtilis ، على نطاق واسع كبروبيوتيك للاستخدام البشري والحيواني2. نظرا لمقاومتها وخصائص سلامتها ، تم اقتراح بوغ B. subtilis ، الذي يعرض بروتينات غير متجانسة ، كمساعد مخاطي ، ونظام توصيل لقاح ، ومنصة تثبيت الإنزيم 3,4.
للحصول على جراثيم من B. subtilis ، من الضروري تعريضها للحرمان من المغذيات باستخدام وسيط ثقافة خاص. بعد الحصول على هذه الجراثيم وتنقيتها ، يجب على المرء تحديدها كميا لتحسين كفاءة الاختبار 5,6. وبالتالي ، يتم تطبيق طرق معينة لتحليل تركيز الجراثيم التي تم الحصول عليها. يمكن استخدام عد الألواح وغرفة Petroff-Hausser ، والمعروفة أيضا باسم غرفة العد. تم تطوير هذا الأخير في الأصل لتحديد تركيز خلايا الدم. ومع ذلك ، فمن الممكن استخدامه في مجال علم الأحياء الدقيقة لعد الأبواغ 7,8. على الرغم من كونها الطريقة القياسية المستخدمة في عد الخلايا ، إلا أن القراءة شاقة لأن هذه الطريقة يدوية تماما وتعتمد دقتها على خبرة المشغل.
تم اقتراح التحليلات القائمة على قياس التدفق الخلوي (FC) سابقا كنهج سريعة وموثوقة ومحددة للكشف عن الخلايا الموسومة ل Bacillus spp. يضمن استخدام حبات عد التدفق الخلوي قابلية التكاثر في عد الخلايا في الفحوصات الروتينية (العدد المطلق للخلايا الليمفاوية CD4 و CD8 T) وفي تطوير الأبحاث التي تتضمن جزيئات يمكن اكتشافها وحسابها باستخدام قياس التدفقالخلوي 9. اقترح جودجافري والشريف استخدام عد الخرز لتحديد كمية FC للجراثيم غير الموسومة10. تم وصف استخدام قياس التدفق الخلوي لرصد التبويض في Bacillus spp. عن طريق وضع علامات على الحمض النووي للجراثيم10،11،12،13. ومع ذلك ، استخدمت دراسة أخرى FC لتقييم كمية البروتينات الموسومة بالفلورسنت على سطح البوغ15.
سعت هذه الدراسة إلى استخدام حبات العد التجارية لضمان معيار من التكاثر فيما يتعلق بحساب الأحداث باستخدام قياس التدفق الخلوي. هنا ، نقترح استخدام عد حبات عد الخلايا في FC لتحسين تعداد الأبواغ وتقييم كفاءة اقتران الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية على سطح البوغ.
الطرق التقليدية ، مثل عد لوحات المستعمرات ، لا تستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل تحتاج أيضا إلى خلايا قابلة للحياة ولا تسمح بقياس كمية الجراثيم المعطلة5. غرفة بتروف-هوسر هي منهجية بديلة ، لكنها تتطلب مجهريا متمرسا لتنفيذها. أثبت قياس التدفق الخلوي أنه بديل مفيد لهذا الغرض.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) – قانون المالية 001. Governo do Estado do Amazonas بموارد من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq). يشكر المؤلفون برنامج التطوير التكنولوجي في أدوات الصحة PDTIS-FIOCRUZ على استخدام مرافقه.
((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
(N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |