Aprimoramento da Enumeração de Esporos de Bacillus subtilis e Análise de Marcação em Citometria de Fluxo
Summary
Este protocolo enfoca o uso de citometria de fluxo e contagem de esferas para quantificar esporos bacterianos marcados com brometo de etídio. O método também é eficiente para analisar o acoplamento covalente de proteínas na superfície de esporos intactos.
Abstract
Os esporos de Bacillus subtilis já foram propostos para diferentes aplicações biotecnológicas e imunológicas; No entanto, há uma necessidade crescente para o desenvolvimento de metodologias que melhorem a detecção de antígenos imobilizados na superfície de esporos juntamente com sua quantificação. Análises baseadas em citometria de fluxo têm sido previamente propostas como abordagens rápidas, confiáveis e específicas para a detecção de células marcadas de B. subtilis. Neste trabalho, propomos o uso da citometria de fluxo para avaliar a eficiência de exibição de um anticorpo fluorescente (AG) na superfície do esporo e quantificar o número de esporos usando esferas de contagem.
Para isso, utilizamos brometo de etídio como marcador de DNA e um anticorpo marcado com aloficocianina (APC), que foi acoplado aos esporos, como marcador de superfície. A quantificação dos esporos foi realizada por meio da contagem de contas, uma vez que esta técnica demonstra alta acurácia na detecção das células. Os esporos marcados foram analisados por citômetro de fluxo, que confirmou o acoplamento. Como resultado, demonstrou-se que a marcação de DNA melhorou a precisão da quantificação por citometria de fluxo, para a detecção de esporos germinados. Observou-se que o brometo de etídio não foi capaz de marcar esporos dormentes; No entanto, esta técnica fornece uma determinação mais precisa do número de esporos com proteína fluorescente acoplada à sua superfície, auxiliando assim no desenvolvimento de estudos que enfoquem o uso de esporos como plataforma biotecnológica em diferentes aplicações.
Introduction
Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, em forma de bastonete, capaz de produzir esporos quiescentes quando as condições ambientais não permitem o crescimento celular1. Os esporos são formas celulares extremamente estáveis e os de várias espécies, incluindo B. subtilis, são amplamente utilizados como probióticos para uso humano e animal2. Devido às suas propriedades de resistência e segurança, o esporo de B. subtilis, que apresenta proteínas heterólogas, tem sido proposto como adjuvante da mucosa, sistema de liberação vacinal e plataforma enzimática 3,4.
Para obter esporos de B. subtilis, é necessário expô-lo à privação de nutrientes usando um meio de cultura especial. Após a obtenção e purificação desses esporos, deve-se quantificá-los para melhorar a eficiência do teste 5,6. Assim, alguns métodos são aplicados para analisar a concentração dos esporos obtidos. A contagem de placas e uma câmara de Petroff-Hausser, também conhecida como câmara de contagem, podem ser usadas. Este último foi originalmente desenvolvido para determinar a concentração de células sanguíneas; entretanto, é possível utilizá-lo no campo da microbiologia para contagem deesporos7,8. Apesar de ser o método padrão utilizado para contagem celular, a leitura é trabalhosa, pois este método é totalmente manual e sua precisão depende da experiência do operador.
Análises baseadas em citometria de fluxo (FC) têm sido previamente propostas como abordagens rápidas, confiáveis e específicas para a detecção de células marcadas de Bacillus spp. O uso de esferas de contagem por citometria de fluxo tem garantido reprodutibilidade na contagem celular em exames de rotina (contagem absoluta de linfócitos T CD4 e CD8) e no desenvolvimento de pesquisas envolvendo partículas passíveis de serem detectadas e contadas por citometria defluxo9. Godjafrey e Alsharif sugeriram o uso de contas de contagem para quantificação de CF de esporos não marcados10. O uso da citometria de fluxo foi descrito para o monitoramento da esporulação em Bacillus spp. através da marcação do DNA dos esporos 10,11,12,13. Outro estudo utilizou a CF para avaliar a quantidade de proteínas marcadas fluorescentemente na superfície dos esporos15.
Este estudo buscou utilizar esferas de contagem comerciais para garantir um padrão de reprodutibilidade em relação à contagem de eventos por citometria de fluxo. Neste trabalho, sugerimos o uso de esferas de contagem para contagem de células em FC para refinar a enumeração de esporos e avaliar a eficiência de acoplamento de anticorpos marcados fluorescentemente na superfície dos esporos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos tradicionais, como a contagem em placas de colônias, não só são demorados, como também necessitam de células viáveis e não permitem a quantificação de esporos inativados5. A câmara de Petroff-Hausser é uma metodologia alternativa, mas requer um microscopista experiente para realizá-la. A citometria de fluxo tem se mostrado uma alternativa útil para esse fim.
Genovese et al.12 descreveram o uso da citometria de fluxo para a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código 001; Governo do Estado do Amazonas com recursos da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Os autores agradecem ao Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Ferramentas para a Saúde PDTIS-FIOCRUZ pela utilização de suas instalações.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
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