Verbesserung der Bacillus subtilis-Sporenzählung und Markierungsanalyse in der Durchflusszytometrie
Summary
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und Zählperlen zur Quantifizierung von Bakteriensporen, die mit Ethidiumbromid markiert sind. Die Methode ist auch effizient, um die kovalente Kopplung von Proteinen auf der Oberfläche intakter Sporen zu analysieren.
Abstract
Die Sporen von Bacillus subtilis wurden bereits für verschiedene biotechnologische und immunologische Anwendungen vorgeschlagen; Es besteht jedoch ein zunehmender Bedarf an der Entwicklung von Methoden, die den Nachweis von Antigenen, die auf der Oberfläche von Sporen immobilisiert sind, sowie deren Quantifizierung verbessern. Auf Durchflusszytometrie basierende Analysen wurden bereits als schnelle, zuverlässige und spezifische Ansätze zum Nachweis markierter Zellen von B. subtilis vorgeschlagen. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung der Durchflusszytometrie vor, um die Anzeigeeffizienz eines fluoreszierenden Antikörpers (FA) auf der Oberfläche der Spore zu bewerten und die Anzahl der Sporen mit Hilfe von Zählkügelchen zu quantifizieren.
Dazu verwendeten wir Ethidiumbromid als DNA-Marker und einen Allophycocyanin (APC)-markierten Antikörper, der an die Sporen gekoppelt war, als Oberflächenmarker. Die Quantifizierung der Sporen wurde mit Hilfe von Zählkügelchen durchgeführt, da diese Technik eine hohe Genauigkeit bei der Detektion von Zellen aufweist. Die markierten Sporen wurden mit einem Durchflusszytometer analysiert, was die Kopplung bestätigte. Als Ergebnis konnte gezeigt werden, dass die DNA-Markierung die Genauigkeit der Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie für den Nachweis von gekeimten Sporen verbessert. Es wurde beobachtet, dass Ethidiumbromid nicht in der Lage war, ruhende Sporen zu markieren; Diese Technik ermöglicht jedoch eine genauere Bestimmung der Anzahl der Sporen mit fluoreszierendem Protein, die an ihre Oberfläche gekoppelt sind, und hilft so bei der Entwicklung von Studien, die sich auf die Verwendung von Sporen als biotechnologische Plattform in verschiedenen Anwendungen konzentrieren.
Introduction
Bacillus subtilis ist ein stäbchenförmiges, grampositives Bakterium, das in der Lage ist, ruhende Sporen zu produzieren, wenn die Umweltbedingungen kein Zellwachstum zulassen1. Sporen sind extrem stabile Zellformen, und die Sporen mehrerer Arten, einschließlich B. subtilis, werden häufig als Probiotika für den menschlichen und tierischen Gebrauch verwendet2. Aufgrund ihrer Resistenz- und Sicherheitseigenschaften wurde die Spore von B. subtilis, die heterologe Proteine aufweist, als Schleimhautadjuvans, als Impfstoffverabreichungssystem und als Enzymimmobilisierungsplattform vorgeschlagen 3,4.
Um Sporen von B. subtilis zu erhalten, ist es notwendig, sie mit einem speziellen Nährmedium einem Nährstoffentzug auszusetzen. Nach der Gewinnung und Reinigung dieser Sporen müssen sie quantifiziert werden, um die Testeffizienz zu verbessern 5,6. Daher werden bestimmte Methoden angewendet, um die Konzentration der erhaltenen Sporen zu analysieren. Es kann eine Plattenzählung und eine Petroff-Hausser-Kammer, auch Zählkammer genannt, verwendet werden. Letzteres wurde ursprünglich entwickelt, um die Konzentration von Blutzellen zu bestimmen; Es ist jedoch möglich, es im Bereich der Mikrobiologie für die Sporenzählung zu verwenden 7,8. Obwohl es sich um die Standardmethode für die Zellzählung handelt, ist das Ablesen mühsam, da diese Methode vollständig manuell ist und ihre Genauigkeit von der Erfahrung des Bedieners abhängt.
Durchflusszytometrie-basierte (FC) Analysen wurden bereits als schnelle, zuverlässige und spezifische Ansätze zum Nachweis markierter Zellen von Bacillus spp. vorgeschlagen. Die Verwendung von Durchflusszytometrie-Zählkügelchen hat die Reproduzierbarkeit bei der Zellzählung bei Routineuntersuchungen (absolute Zählung von CD4- und CD8-T-Lymphozyten) und bei der Entwicklung von Forschungsarbeiten mit Partikeln gewährleistet, die mit der Durchflusszytometrie nachgewiesen und gezählt werden können9. Godjafrey und Alsharif schlugen die Verwendung von Zählkügelchen zur FC-Quantifizierung von unmarkierten Sporen vor10. Der Einsatz der Durchflusszytometrie zur Überwachung der Sporulation bei Bacillus spp. durch Markierung der Sporen-DNA 10,11,12,13. In einer weiteren Studie wurde FC verwendet, um die Menge an fluoreszenzmarkierten Proteinen auf der Sporenoberfläche zu bewerten15.
Ziel dieser Studie war es, kommerzielle Zählkügelchen zu verwenden, um einen Standard der Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Ereigniszählung mittels Durchflusszytometrie zu gewährleisten. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung von Zählkügelchen für die Zellzählung in FC vor, um die Sporenzählung zu verfeinern und die Kopplungseffizienz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf der Sporenoberfläche zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herkömmliche Methoden, wie z.B. die Plattenzählung von Kolonien, sind nicht nur zeitaufwändig, sondern benötigen auch lebensfähige Zellen und erlauben keine Quantifizierung von inaktivierten Sporen5. Die Petroff-Hausser-Kammer ist eine alternative Methode, aber sie erfordert einen erfahrenen Mikroskopiker, um sie durchzuführen. Die Durchflusszytometrie hat sich hierfür als sinnvolle Alternative erwiesen.
Genovese et al.12 beschrieben die V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil durch den Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 finanziert; Governo do Estado do Amazonas mit Mitteln der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Die Autoren danken dem Programm für die technologische Entwicklung von Instrumenten für die Gesundheit PDTIS-FIOCRUZ für die Nutzung seiner Einrichtungen.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
