Ferritinofagia: evaluación de la degradación selectiva del hierro por autofagia en fibroblastos humanos

1. Cultivo y siembra de células primarias Tome el frasco con células congeladas del tanque de nitrógeno líquido y manténgalo en hielo hasta que llegue a la sala de cultivo celular. En una capucha previamente esterilizada, sostenga el vial en la mano para que la suspensión celular se descongele. Resuspender las células y transferirlas a una placa de cultivo celular de 10 cm con 9 mL de DMEM precalentado con 10% de suero fetal de ternera (FCS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Agitar suavemente para que las células se distribuyan uniformemente en la placa e incubar durante la noche a 37 °C y 5% de CO2 A la mañana siguiente, mire las celdas para confirmar que están unidas. Cambie el medio a DMEM fresco + 10% FCS + 1% P/S, y deje que las células crezcan hasta que alcancen el 80% de confluencia. Retirar el medio de cultivo, lavar 2 veces con DPBS, añadir 1 mL de tripsina a la placa e incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 10 min. Agregue 9 mL de DMEM + 10% FCS a la placa y vuelva a suspender las células. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL. Determine el recuento de células manualmente utilizando una cámara de Neubauer y diluya la suspensión celular en DMEM + 10% FCS hasta alcanzar una concentración celular de 40.000 células/mL. En una placa de 96 pocillos con fondo de vidrio, siembre 100 μL/pocillo de la suspensión celular. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 16 h. 2. Tratamientos Prepare los siguientes tratamientos de acuerdo con la Tabla de Materiales: medio de control, medio de control más deferasiox (DFX) para la quelación del hierro, o medio de control más citrato de amonio férrico (FAC) para la carga de hierro. Preparar todos los tratamientos tanto en presencia como en ausencia de un inhibidor lisosomal (bafilomycina A1) para la evaluación del flujo de ferritinofagia. Retire el medio de cultivo de la placa y reemplácelo con el tratamiento correspondiente (100 μL/pocillo). Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 6 h. 3. Fijación y tinción Aspire el medio de tratamiento y lave 2 veces con DPBS (Tabla de Materiales). Agregue 100 μL de paraformaldehído al 3,7% (PFA, Tabla de Materiales) por pocillo. Fije las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire el PFA y lave las celdas 2 veces con PBS/T (Tabla de Materiales). Bloque en PBS/T que contiene 1% de albúmina sérica bovina (BSA) durante 1 h a 4 °C. Prepare la mezcla de anticuerpos primarios (Tabla de materiales) en PBS/T (anticuerpo de ferritina 1:50, anticuerpo LAMP2 1:50). Lave las células 2 veces con PBS/T y aplique 50 μL de la mezcla de anticuerpos por pocillo. Envuelva las placas con parafilm e incube durante la noche a 4 °C. A la mañana siguiente, prepare la mezcla de anticuerpos secundarios (Tabla de Materiales) (1:200) en PBS/T. Lave las células 2 veces con PBS/T y aplique 50 μL de la mezcla de anticuerpos secundarios por pocillo. Incubar a 4 °C durante 1 h en la oscuridad. Prepare 5 μg/μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Tabla de Materiales) en PBS a temperatura ambiente. Lave las células 2 veces con PBS/T y añada 100 μL/pocillo de tinción DAPI. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las celdas 2 veces con PBS y agregue 50 μL de PBS a cada pocillo. Envuelva las placas con parafilm y guárdelas a 4 °C en la oscuridad. 4. Imágenes automatizadas mediante microscopía de barrido láser confocal Cambie el PBS de la placa por 50 μL de PBS fresco a temperatura ambiente. Cubra la placa con papel de aluminio y llévela a la sala de microscopía. Encienda el microscopio de escaneo láser confocal, coloque un soporte de muestras para placas de 96 pocillos en la mesa del microscopio y seleccione un objetivo apropiado (aquí: 40x). Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles. Ajuste la configuración de imágenes (Tabla 1).En Smart Setup, seleccione los láseres y filtros, y asígnelos a pistas (pistas 1-3) para obtener una calidad de imagen y una velocidad óptimas (Tabla 1). Al seleccionar el tipo de experimento, haga clic en Mosaicos para habilitar la opción de seleccionar y guardar las posiciones X,Y determinadas en la placa. En el módulo Configuración de imágenes , visualice los canales de adquisición, las pistas asignadas a ellos y sus longitudes de onda de excitación y emisión (Tabla 1). En el módulo Modo de adquisición, seleccione lo siguiente: Velocidad de escaneo: 6; Dirección: bidireccional; Promedio: 2x; Bits por píxel: 8. En el módulo Canales , ajuste la potencia del láser, el estenopeico y la ganancia maestra para cada canal individualmente (Tabla 2). Ajuste estos parámetros para lograr imágenes correctamente expuestas sin sobresaturarlas. Haga clic en el módulo Estrategia de enfoque .Seleccione Combinar enfoque automático de software y enfoque definido. En Canal de referencia y desplazamientos, seleccione el canal más estable/brillante como referencia (normalmente DAPI o 488 nm). En Repeticiones y frecuencia de eventos de estabilización, seleccione Estándar. En el módulo Enfoque automático de software , seleccione lo siguiente: Modo | Intensidad; Buscar | Inteligente; Muestreo | Multa; Rango relativo. Haga clic en el módulo Mosaicos .Seleccione Posiciones | posiciones individuales. En Configuración avanzada, navegue por la placa, identifique una posición para la obtención de imágenes y haga clic en el botón + en la pestaña Configuración de posición . Etiquete cada posición con información adicional que se registrará en los metadatos de la imagen. Para ello, abra la pestaña Propiedades , haga clic en el icono de la rueda junto al menú desplegable Categoría y haga clic en Nuevo para abrir un nuevo cuadro de diálogo donde se introducirá el nuevo nombre de la categoría. Para asignar una categoría a una posición determinada, seleccione la posición, haga clic en la pestaña Propiedades , vaya al menú desplegable Categorías y seleccione la etiqueta correspondiente.NOTA: Se recomienda crear una categoría para cada tratamiento para etiquetar cada posición con el tratamiento al que se sometieron las células. En Portador de muestras, seleccione Fondo de vidrio Multiwell 96-Cellvis #0. Haga clic en Calibrar para calibrar el microscopio con la superficie de la placa. Elija entre calibración de 1 punto o 7 puntos en función de las especificaciones del sistema. En Opciones, seleccione una superposición de mosaicos del 10%. En Viajar en regiones de mosaicos, seleccione Peine. Marque lo siguiente: usar la velocidad de la etapa desde el control de etapa, usar la aceleración de la etapa desde el control de etapa y la pirámide de imágenes durante la adquisición. Ejecute la adquisición de imágenes y guarde los resultados de la imagen (archivos czi) y los metadatos de la imagen (archivos csv) en un disco duro portátil. Exporte las imágenes como archivos TIFF. 5. Análisis de imágenes de alto rendimiento Cree un archivo de hoja de cálculo de metadatos independiente con las siguientes columnas: Posición, Pozo, Condición, Serie y Conjunto. Los datos apropiados para rellenar estas columnas se recuperan del archivo de metadatos original que proviene de la microscopía de barrido láser confocal. Descargue el software de código abierto CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases). Inicie CellProfiler 4.2.4 haciendo doble clic e importe la canalización de CellProfiler (archivo complementario 1) arrastrando y soltando.NOTA: A continuación, encontrará los pasos para compilar la canalización de CellProfiler (Archivo complementario 1) para el reconocimiento automatizado de fibroblastos mediante tinción DAPI (Módulo 1, reconocimiento de núcleos, consulte la Tabla 2) y fluorescencia de fondo en células individuales derivadas de AF488 (Módulo 2, reconocimiento celular, consulte la Tabla 2). El reconocimiento de puntos (denominados objetos) está determinado por el tamaño de los puntos y la intensidad de fluorescencia de los puntos sobre el fondo (Módulo 3, reconocimiento de puntos, véase la Tabla 2). Finalmente, de acuerdo con los límites de las celdas, los puntos reconocidos por el software se asignan a las celdas correspondientes (Asignar relaciones). Anteriormente se ha publicado una descripción detallada de cómo implementar una canalización de CellProfiler para estudios de autofagia9. Además, la tabla 2 contiene la configuración de CellProfiler utilizada en este estudio. Además, el archivo complementario 2 muestra la canalización de CellProfiler (archivo complementario 1) con capturas de pantalla tomadas en orden consecutivo y que hacen referencia a los módulos detallados en la tabla 2. Antes de adaptar la canalización de CellProfiler (archivo complementario 1), arrastre y suelte archivos de imagen .czi individuales o una carpeta que contenga varios archivos de imagen .czi en el módulo Imagen . Personalice la canalización de reconocimiento de imágenes. En el módulo Nombres y tipos , sustituya el código c1-c3 por un código que permita al software identificar y ordenar las imágenes de un solo canal que se van a analizar. Ajuste la configuración de la canalización para los módulos IdentifyPrimaryObjects e IdentifySecondaryObjects optimizando las entradas numéricas de los módulos. Los valores utilizados en este estudio se presentan en la Tabla 2. Para realizar un seguimiento de los ajustes, seleccione la opción Modo de prueba haciendo clic en el botón Iniciar modo de prueba . A continuación, haga clic en el botón Paso entre los módulos. Espere a que aparezcan ventanas emergentes (la imagen de entrada original, los contornos de reconocimiento dibujados sobre la imagen original y el resultado del análisis) que muestren cómo se analizaría una imagen con la configuración que se acaba de introducir. Una vez optimizada la canalización, finalice el modo de prueba. Ejecute el análisis activando el modo de prueba de salida, seguido de clic en el botón Analizar imágenes . Una vez completado el análisis, compruebe la precisión de la detección de celdas y puntos comparando las imágenes de entrada con las salidas de superposición (límites de celda, puntuación) generadas por CellProfiler. Si no es satisfactorio, ajuste los valores numéricos en los diferentes módulos (Tabla 2) hasta que el resultado del análisis sea lo suficientemente preciso. 6. Análisis de datos Después de ejecutar el análisis, espere a que el software cree un conjunto de archivos de texto tabular con los resultados. Si usa la canalización CellProfiler proporcionada (archivo complementario 1), busque los siguientes archivos de salida:El archivo CellProfilerOutputCells , que enumera el número de imagen asignado por el software, el número de celda asignado a celdas individuales, el nombre del archivo original y la ruta que indica dónde se almacenan los archivos, el número de puntos (ferritina, LAMP2) por celda y el área media de puntos (ferritina, LAMP2) por celda. El archivo CellProfilerOutputExperiment , que proporciona información sobre los detalles técnicos relacionados con el experimento (por ejemplo, la versión del software, los canales de imagen, las etiquetas de metadatos). Abra estos archivos como hojas de cálculo. Proceda a realizar el análisis estadístico de los recuentos de puntos y los números de colocalización de puntos utilizando el software de estadísticas preferido (Tabla de Materiales).