Ferritinofagia: Valutazione della degradazione selettiva del ferro mediante autofagia nei fibroblasti umani

1. Coltura e semina delle cellule primarie Prendi la fiala con le cellule congelate dal serbatoio dell’azoto liquido e tienila in ghiaccio fino a raggiungere la stanza di coltura cellulare. In un cappuccio precedentemente sterilizzato, tenere la fiala in mano in modo che la sospensione cellulare si scongeli. Risospendere le cellule e trasferirle in una piastra di coltura cellulare di 10 cm con 9 ml di DMEM preriscaldato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) e l’1% di penicillina-streptomicina (P/S). Agitare delicatamente in modo che le cellule si distribuiscano uniformemente sulla piastra e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO2 La mattina seguente, guarda le celle per confermare che sono attaccate. Cambia il terreno in DMEM fresco + 10% FCS + 1% P/S e lascia che le cellule crescano fino a raggiungere l’80% di confluenza. Rimuovere il terreno di coltura, lavare 2 volte con DPBS, aggiungere 1 mL di tripsina alla piastra e incubarla a 37 °C e 5% di CO2 per 10 minuti. Aggiungere 9 mL di DMEM + 10% FCS alla piastra e risospendere le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL. Determinare manualmente la conta cellulare utilizzando una camera Neubauer e diluire la sospensione cellulare in DMEM + 10% FCS fino a raggiungere una concentrazione cellulare di 40.000 cellule/mL. In una piastra a 96 pozzetti con fondo di vetro, seminare 100 μL/pozzetto della sospensione cellulare. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 16 ore. 2. Trattamenti Preparare i seguenti trattamenti secondo la Tabella dei Materiali: terreno di controllo, terreno di controllo più deferasiox (DFX) per la chelazione del ferro o mezzo di controllo più citrato di ammonio ferrico (FAC) per il caricamento del ferro. Preparare tutti i trattamenti sia in presenza che in assenza di un inibitore lisosomiale (bafilomicina A1) per la valutazione del flusso ferritinofagico. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra e sostituirlo con il trattamento corrispondente (100 μL/pozzetto). Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 6 ore. 3. Fissazione e colorazione Aspirare il mezzo di trattamento e lavare 2 volte con DPBS (Table of Materials). Aggiungere 100 μl di paraformaldeide al 3,7% (PFA, Table of Materials) per pozzetto. Fissare le celle per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Rimuovere il PFA e lavare le celle 2 volte con PBS/T (Tabella dei materiali). Blocco in PBS/T contenente l’1% di albumina sierica bovina (BSA) per 1 ora a 4 °C. Preparare la miscela di anticorpi primari (Tabella dei materiali) in PBS/T (anticorpo ferritina 1:50, anticorpo LAMP2 1:50). Lavare le cellule 2 volte con PBS/T e applicare 50 μl di miscela di anticorpi per pozzetto. Avvolgere le piastre con parafilm e incubare per una notte a 4 °C. La mattina seguente, preparare la miscela di anticorpi secondari (Tabella dei materiali) (1:200) in PBS/T. Lavare le cellule 2 volte con PBS/T e applicare 50 μl della miscela di anticorpi secondari per pozzetto. Incubare a 4 °C per 1 ora al buio. Preparare una soluzione di 5 μg/μl di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, Tabella dei materiali) in PBS a temperatura ambiente. Lavare le cellule 2 volte con PBS/T e aggiungere 100 μL/pozzetto di colorante DAPI. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare le cellule 2 volte con PBS e aggiungere 50 μL di PBS a ciascun pozzetto. Avvolgere le piastre con parafilm e conservare a 4 °C al buio. 4. Imaging automatizzato mediante microscopia confocale a scansione laser Sostituire il PBS nella piastra con 50 μl di PBS fresco a temperatura ambiente. Coprite la piastra con un foglio di alluminio e portatela in sala microscopia. Accendere il microscopio confocale a scansione laser, posizionare un supporto per campioni per piastre da 96 pozzetti sul tavolo del microscopio e selezionare un obiettivo appropriato (qui: 40x). Fare riferimento alla Tabella 1 per i dettagli. Regolare le impostazioni di imaging (Tabella 1).In Smart Setup, selezionare i laser e i filtri e assegnarli alle tracce (Tracce 1-3) per ottenere una qualità e una velocità dell’immagine ottimali (Tabella 1). Quando si seleziona il tipo di esperimento, fare clic su Tessere per abilitare l’opzione di selezionare e salvare le posizioni X,Y determinate sulla piastra. Nel modulo Imaging Setup , visualizzare i canali di acquisizione, le tracce ad essi assegnate e le loro lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione (Tabella 1). Nel modulo Modalità di acquisizione, selezionare quanto segue: Velocità di scansione: 6; Direzione: bidirezionale; Media: 2x; Bit per pixel: 8. Nel modulo Canali , regolare la potenza del laser, il foro stenopeico e il guadagno master per ciascun canale individualmente (Tabella 2). Ottimizza questi parametri per ottenere immagini correttamente esposte senza saturarle eccessivamente. Fare clic sul modulo Strategia di messa a fuoco .Selezionare Combina software Autofocus e Messa a fuoco definita. In Canale di riferimento e offset, selezionare il canale più stabile/più luminoso come riferimento (normalmente DAPI o 488 nm). In Ripetizioni e frequenza degli eventi di stabilizzazione, selezionare Standard. Nel modulo Autofocus software , selezionare quanto segue: Modalità | Intensità; Ricerca | Intelligente; Campionatura | Bene; Intervallo relativo. Fare clic sul modulo Riquadri .Seleziona Posizioni | posizioni singole. In Configurazione avanzata, navigare nella piastra, identificare una posizione per l’imaging e fare clic sul pulsante + nella scheda Impostazione posizione . Etichetta ogni posizione con informazioni aggiuntive che verranno registrate sui metadati dell’immagine. Per fare ciò, apri la scheda Proprietà , fai clic sull’icona della rotellina accanto al menu a discesa Categoria e fai clic su Nuovo per aprire una nuova finestra di dialogo in cui deve essere inserito il nome della nuova categoria . Per assegnare una categoria a una determinata posizione, selezionare la posizione, fare clic sulla scheda Proprietà , andare al menu a discesa Categorie e selezionare l’etichetta corrispondente.NOTA: Si consiglia di creare una categoria per ogni trattamento per etichettare ogni posizione con il trattamento a cui sono state sottoposte le cellule. In Sample Carrier (Portacampioni), selezionare Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0 (fondo in vetro Multiwell 96-Cellvis) #0. Fare clic su Calibra per calibrare il microscopio sulla superficie della piastra. Scegli tra la calibrazione a 1 punto o a 7 punti a seconda delle specifiche del sistema. In Opzioni, selezionare una sovrapposizione di tessere del 10%. In Viaggia nelle regioni delle tessere, seleziona Pettine. Selezionare le seguenti opzioni: utilizzare la velocità del tavolino dal controllo del tavolino, utilizzare l’accelerazione del tavolino dal controllo del tavolino e la piramide dell’immagine durante l’acquisizione. Eseguire l’acquisizione dell’immagine e salvare i risultati dell’immagine (file CZI) e i metadati dell’immagine (file csv) su un disco rigido portatile. Esporta le immagini come file TIFF. 5. Analisi delle immagini ad alto rendimento Crea un foglio di calcolo di metadati separato con le seguenti colonne: Posizione, Pozzetto, Condizione, Serie e Set. I dati appropriati per riempire queste colonne vengono recuperati dal file di metadati originale proveniente dalla microscopia confocale a scansione laser. Scarica il software open source CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases). Avviare CellProfiler 4.2.4 facendo doppio clic e importare la pipeline di CellProfiler (file supplementare 1) mediante trascinamento della selezione.NOTA: Di seguito sono riportati i passaggi per compilare la pipeline CellProfiler (File supplementare 1) per il riconoscimento automatico dei fibroblasti utilizzando la colorazione DAPI (Modulo 1, riconoscimento dei nuclei, vedere la Tabella 2) e la fluorescenza di fondo in singole cellule derivate da AF488 (Modulo 2, riconoscimento cellulare, vedere la Tabella 2). Il riconoscimento dei puncta (chiamati oggetti) è determinato dalla dimensione dei puncta e dall’intensità della fluorescenza dei puncta sullo sfondo (Modulo 3, riconoscimento dei puncta, vedi Tabella 2). Infine, in base ai confini delle celle, i puncta riconosciuti dal software vengono assegnati alle celle corrispondenti (Assign relationships). Una descrizione dettagliata di come implementare una pipeline CellProfiler per gli studi sull’autofagia è stata pubblicata in precedenza9. Inoltre, la Tabella 2 contiene le impostazioni di CellProfiler utilizzate in questo studio. Inoltre, il file supplementare 2 visualizza la pipeline CellProfiler (file supplementare 1) con schermate acquisite in ordine consecutivo e che fanno riferimento ai moduli descritti nella tabella 2. Prima di adattare la pipeline CellProfiler (file supplementare 1), trascinare i singoli file di immagine con estensione czi o una cartella contenente più file di immagine con estensione czi nel modulo Image . Personalizzare la pipeline di riconoscimento delle immagini. Nel modulo Nomi e Tipi , sostituire il codice c1-c3 con un codice che permetta al software di identificare e ordinare le immagini a canale singolo da analizzare. Ottimizzare le impostazioni della pipeline per i moduli IdentifyPrimaryObjects e IdentifySecondaryObjects ottimizzando le voci numeriche nei moduli. I valori utilizzati in questo studio sono presentati nella Tabella 2. Per tenere traccia delle regolazioni, selezionare l’opzione Modalità test facendo clic sul pulsante Avvia modalità test . Quindi fare clic sul pulsante Passaggio tra i moduli. Attendi le finestre popup (l’immagine di input originale, i contorni di riconoscimento disegnati sull’immagine originale e il risultato dell’analisi) che mostrano come un’immagine verrebbe analizzata con le impostazioni appena inserite. Una volta ottimizzata la pipeline, terminare la modalità di test. Eseguire l’analisi attivando la modalità di uscita dal test, quindi fare clic sul pulsante Analizza immagini . Al termine dell’analisi, verificare l’accuratezza del rilevamento delle celle e dei punti confrontando le immagini di input con gli output di sovrapposizione (confini delle celle, punti) generati da CellProfiler. In caso di insoddisfazione, regolare i valori numerici nei diversi moduli (Tabella 2) fino a quando il risultato dell’analisi non è sufficientemente accurato. 6. Analisi dei dati Dopo aver eseguito l’analisi, attendere che il software crei un insieme di file di testo tabellari con i risultati. Se si usa la pipeline CellProfiler fornita (file supplementare 1), cercare i file di output seguenti:Il file CellProfilerOutputCells , che elenca il numero di immagine assegnato dal software, il numero di cella assegnato alle singole celle, il nome del file originale e il percorso che indica la posizione in cui sono memorizzati i file, il numero di punti (ferritina, LAMP2) per cella e l’area media dei punti (ferritina, LAMP2) per cella. Il file CellProfilerOutputExperiment, che fornisce informazioni sui dettagli tecnici relativi all’esperimento (ad esempio, la versione del software, i canali delle immagini, i tag dei metadati). Apri questi file come fogli di calcolo. Procedere con l’analisi statistica dei conteggi dei puncta e dei numeri di co-localizzazione dei puncta utilizzando il software di statistica preferito (Table of Materials).