פריטינופגיה: הערכת פירוק סלקטיבי של ברזל על ידי אוטופגיה בפיברובלסטים אנושיים

1. גידול וזריעה של תאים ראשוניים הביאו את הבקבוקון עם התאים הקפואים ממיכל החנקן הנוזלי, ושמרו אותו על קרח עד ההגעה לחדר תרביות התאים. במכסה מנוע מעוקר בעבר, החזיקו את הבקבוקון ביד כך שמתלה התא יפשיר. השהה מחדש את התאים והעבר אותם לצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס”מ עם 9 מ”ל DMEM שחומם מראש עם 10% נסיוב עגל עובר (FCS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). יש לנער בעדינות כך שהתאים יתפזרו באופן שווה על הצלחת, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למחרת בבוקר, הסתכלו על התאים כדי לאשר שהם מחוברים. שנה את המדיום ל- DMEM טרי + 10% FCS + 1% P / S, ותן לתאים לגדול עד שהם מגיעים למפגש של 80%. מוציאים את מדיום התרבית, שוטפים 2x עם DPBS, מוסיפים 1 מ”ל טריפסין לצלחת, ודגרים אותו ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 10 דקות. הוסף 9 מ”ל של DMEM + 10% FCS לצלחת, והשהה מחדש את התאים. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ”ל. קבע את ספירת התאים באופן ידני באמצעות תא נויבאואר, ודלל את תרחיף התא ב- DMEM + 10% FCS עד להשגת ריכוז תאים של 40,000 תאים / מ”ל. בצלחת בעלת תחתית זכוכית של 96 בארות, זרעו 100 μL/well של תרחיף התא. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 16 שעות. 2. טיפולים הכינו את הטיפולים הבאים בהתאם לטבלת החומרים: מדיום בקרה, מדיום בקרה פלוס דפרסיוקס (DFX) לכלציה של ברזל, או מדיום בקרה בתוספת ברזל אמוניום ציטראט (FAC) להעמסת ברזל. הכן את כל הטיפולים הן בנוכחות והן בהיעדר מעכב ליזוזומלי (bafilomycin A1) להערכת שטף פריטינופגיה. מוציאים את מדיום התרבית מהצלחת, ומחליפים אותו בטיפול המתאים (100 מיקרוליטר/באר). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 6 שעות. 3. קיבוע והכתמה שאפו את מדיום הטיפול, ושטפו 2x עם DPBS (טבלת חומרים). יש להוסיף 100 μL של 3.7% פרפורמאלדהיד (PFA, Table of Materials) לכל באר. תקן את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את ה- PFA, ושטוף את התאים 2x עם PBS/T (טבלה של חומרים). יש לחסום ב-PBS/T המכיל אלבומין 1% בסרום בקר (BSA) למשך שעה אחת ב-4°C. הכינו את תערובת הנוגדנים הראשונית (טבלת חומרים) ב-PBS/T (נוגדן פריטין 1:50, נוגדן LAMP2 1:50). לשטוף את התאים 2x עם PBS/T, ולמרוח 50 μL של תערובת נוגדנים לכל באר. עוטפים את הצלחות עם parafilm, ולדגור לילה ב 4 °C (75 °F). למחרת בבוקר, הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית (טבלת חומרים) (1:200) ב-PBS/T. לשטוף את התאים 2x עם PBS/T, ולמרוח 50 μL של תערובת נוגדנים משנית לכל באר. לדגור ב 4 °C במשך 1 שעה בחושך. הכן תמיסת 5 מיקרוגרם/μL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Table of Materials) ב-PBS בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים 2x עם PBS/T, והוסיפו 100 μL/well של כתם DAPI. יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את התאים 2x עם PBS, והוסיפו 50 μL של PBS לכל באר. עטפו את הצלחות בפרפילם, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. 4. הדמיה אוטומטית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר החליפו את PBS בצלחת ב-50 מיקרוליטר PBS טרי בטמפרטורת החדר. מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום ולוקחים אותה לחדר המיקרוסקופ. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי לסריקת לייזר, הגדר מחזיק דגימה ללוחות 96 בארות על שולחן המיקרוסקופ, ובחר מטרה מתאימה (כאן: 40x). עיין בטבלה 1 לקבלת פרטים. התאם את הגדרות ההדמיה (טבלה 1).בהגדרה חכמה, בחר את הלייזרים והמסננים והקצה אותם לרצועות (רצועות 1-3) לקבלת איכות תמונה ומהירות מיטביות (טבלה 1). בעת בחירת סוג הניסוי, לחץ על אריחים כדי לאפשר את האפשרות לבחור ולשמור את המיקומים שנקבעו X,Y על הצלחת. במודול Imaging Setup , הצג באופן חזותי את ערוצי הרכישה, את המסלולים שהוקצו להם ואת אורכי גל העירור והפליטה שלהם (טבלה 1). במודול מצב רכישה, בחר את האפשרויות הבאות: מהירות סריקה: 6; כיוון: דו כיווני; ממוצע: פי 2; סיביות לפיקסל: 8. במודול ערוצים , התאם את עוצמת הלייזר, חור הסיכה והרווח הראשי עבור כל ערוץ בנפרד (טבלה 2). כוונן פרמטרים אלה כדי להשיג תמונות חשופות כהלכה מבלי להרוות אותן יתר על המידה. לחץ על מודול אסטרטגיית מיקוד .בחר שלב מיקוד אוטומטי של תוכנה ומיקוד מוגדר. תחת ערוץ התייחסות והסטות, בחר את הערוץ היציב/בהיר ביותר כהפניה (בדרך כלל DAPI או 488 nm). תחת חזרות ותדירות של אירועי ייצוב, בחר רגיל. במודול מיקוד אוטומטי של תוכנה , בחר את האפשרויות הבאות: מצב | עוצמת; חיפוש | חכם; דגימה | קנס; טווח יחסי. לחץ על מודול אריחים .בחר משרות | עמדות בודדות. תחת הגדרות מתקדמות, נווט בין הלוח, זהה מיקום להדמיה, ולחץ על לחצן + תחת הכרטיסייה הגדרת מיקום . תייג כל מיקום במידע נוסף שיירשם במטא-נתונים של התמונה. לשם כך, פתח את הכרטיסייה מאפיינים , לחץ על סמל הגלגל לצד התפריט הנפתח קטגוריה ולחץ על חדש כדי לפתוח תיבת דו-שיח חדשה שבה יש להזין את שם הקטגוריה החדשה . כדי להקצות קטגוריה למיקום מסוים, בחר את המיקום, לחץ על הכרטיסייה מאפיינים , עבור לתפריט הנפתח קטגוריות ובחר את התווית המתאימה.הערה: מומלץ ליצור קטגוריה לכל טיפול כדי לתייג כל עמדה עם הטיפול שהתאים היו נתונים לו. תחת ספק דוגמה, בחר Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0. לחץ על כיול כדי לכייל את המיקרוסקופ למשטח הצלחת. בחר בין כיול של נקודה אחת או 7 נקודות בהתאם למפרט המערכת. תחת אפשרויות, בחר חפיפת אריח של 10%. תחת נסיעות באזורי אריחים, בחר מסרק. סמן את האפשרויות הבאות: השתמש במהירות שלב מבקרת במה, השתמש בהאצת שלב מבקרת במה ובפירמידת תמונות במהלך הרכישה. הפעל רכישת תמונה ושמור את תוצאות התמונה (קובצי cci) ואת המטא-נתונים של התמונה (קובצי csv) בכונן קשיח נייד. ייצוא התמונות כקובצי TIFF. 5. ניתוח תמונה בתפוקה גבוהה צור קובץ גיליון אלקטרוני נפרד של מטה-נתונים עם העמודות הבאות: מיקום, טוב, תנאי, סידרה והגדרה. הנתונים המתאימים למילוי עמודות אלה מאוחזרים מקובץ המטא-נתונים המקורי שמקורו במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. הורד את תוכנת הקוד הפתוח CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases). הפעל את CellProfiler 4.2.4 על ידי לחיצה כפולה, וייבא את צינור CellProfiler (קובץ משלים 1) על ידי גרירה ושחרור.הערה: להלן השלבים לקומפילציה של צינור CellProfiler (קובץ משלים 1) לזיהוי אוטומטי של פיברובלסטים באמצעות צביעת DAPI (מודול 1, זיהוי גרעינים, ראה טבלה 2) ופלואורסצנטיות רקע בתאים בודדים הנגזרים מ-AF488 (מודול 2, זיהוי תאים, ראה טבלה 2). זיהוי פונקטה (אובייקטים המכונים) נקבע על ידי גודל הפונקטה ועוצמת פלואורסצנטיות הנקב על רקע (מודול 3, זיהוי פונקטה, ראה טבלה 2). לבסוף, על פי גבולות התא, הפונקטה המוכרת על ידי התוכנה מוקצית לתאים המתאימים (הקצאת יחסים). תיאור מפורט של אופן יישום צינור CellProfiler למחקרי אוטופגיה פורסם בעבר9. בנוסף, טבלה 2 מכילה את הגדרות CellProfiler ששימשו במחקר זה. יתר על כן, קובץ משלים 2 מציג את צינור CellProfiler (קובץ משלים 1) עם צילומי מסך שצולמו בסדר עוקב ומתייחסים למודולים המפורטים בטבלה 2. לפני התאמת הצינור CellProfiler (קובץ משלים 1), גרור ושחרר קובצי תמונה בודדים מסוג .czi או תיקייה המכילה קבצי תמונה מרובים מסוג .czi למודול תמונה . התאם אישית את צינור זיהוי התמונה. במודול שמות וסוגים , החלף את קוד c1-c3 בקוד המאפשר לתוכנה לזהות ולמיין את התמונות החד-ערוציות שיש לנתח. כוונן את הגדרות הצינור עבור המודולים IdentifyPrimaryObjects ו- IdentifySecondaryObjects על-ידי מיטוב הערכים המספריים במודולים. הערכים בהם נעשה שימוש במחקר זה מוצגים בטבלה 2. כדי לעקוב אחר ההתאמות, בחר באפשרות מצב בדיקה על-ידי לחיצה על הלחצן Start Test Mode . לאחר מכן לחץ על שלב כפתור בין המודולים. המתן לחלונות מוקפצים (תמונת הקלט המקורית, קווי המתאר של הזיהוי שצוירו מעל התמונה המקורית ותוצאת הניתוח) המראים כיצד תמונה תנותח באמצעות ההגדרות שהוזנו זה עתה. לאחר אופטימיזציה של הצינור, סיים את מצב הבדיקה. בצע את הניתוח על ידי הפעלת מצב בדיקת יציאה, ולאחר מכן לחיצה על כפתור נתח תמונות . לאחר השלמת הניתוח, ודא את הדיוק של זיהוי התא והפונקטה על ידי השוואת תמונות הקלט עם פלטי הכיסוי (גבולות תא, puncta) שנוצרו על-ידי CellProfiler. אם הדבר אינו משביע רצון, התאם את הערכים המספריים במודולים השונים (טבלה 2) עד שתוצאת הניתוח תהיה מדויקת מספיק. 6. ניתוח נתונים לאחר הפעלת הניתוח, המתן עד שהתוכנה תיצור קבוצה של קבצי טקסט טבלאיים עם התוצאות. אם אתה משתמש בצינור CellProfiler שסופק (קובץ משלים 1), חפש את קבצי הפלט הבאים:הקובץ CellProfilerOutputCells , המפרט את מספר התמונה שהוקצה על-ידי התוכנה, את מספר התא שהוקצה לתאים בודדים, את שם הקובץ המקורי ואת הנתיב המציין היכן מאוחסנים הקבצים, את מספר הפונקטה (פריטין, LAMP2) לתא ואת אזור הפונקטה הממוצע (פריטין, LAMP2) לתא. הקובץ CellProfilerOutputExperiment , המספק מידע על הפרטים הטכניים הקשורים לניסוי (למשל, גרסת התוכנה, ערוצי התמונה, תגי המטא-נתונים). פתח קבצים אלה כגליונות אלקטרוניים. המשך לבצע את הניתוח הסטטיסטי של ספירות puncta ומספרי לוקליזציה משותפת של puncta באמצעות תוכנת הסטטיסטיקה המועדפת (Table of Materials).