Ferritinofaji: İnsan Fibroblastlarında Otofaji ile Demirin Seçici Bozunmasının Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, birincil, deriden türetilmiş insan fibroblastlarında yüksek verimli, immünofloresan bazlı ferritinofaji değerlendirmeleri yapmak için ayrıntılı talimatlar sağlar.
Abstract
Otofaji geni WDR45/WIPI4’teki mutasyonlar, hastaların beyinlerinde demir birikintilerinin varlığına bağlı olarak beyin demir birikimi (NBIA) ile nörodejenerasyon olarak bilinen insan hastalıklarının bir alt tipi olan beta-pervane ile ilişkili nörodejenerasyonun (BPAN) nedenidir. Hücre içi demir seviyeleri, ferritinofajinin kritik mekanizması da dahil olmak üzere bir dizi hücresel mekanizma tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu makale, birincil, deri kaynaklı insan fibroblastlarında ferritinofajinin nasıl değerlendirilebileceğini açıklamaktadır. Bu protokolde, lizozom fonksiyonunu inhibe etmek için bafilomisin A1’in uygulanması ve demiri aşırı yüklemek veya tüketmek için sırasıyla ferrik amonyum sitrat (FAC) veya deferasioks (DFX) tedavileri gibi hücresel düzeyde ferritinofajiyi indüklemek veya inhibe etmek için demir modüle edici koşullar kullanıyoruz. Bu tür tedavi edilmiş fibroblastlar daha sonra yüksek verimli görüntülemeye ve endojen ferritin ve otofagozomal / lizozomal belirteçlerin CellProfiler tabanlı kantitatif lokalizasyon analizine tabi tutulur, burada LAMP2. Otofagozomal/lizozomal ferritin seviyesine bağlı olarak, ferritinofaji seviyesi ile ilgili sonuçlar çıkarılabilir. Bu protokol, BPAN hastadan türetilen primer fibroblastlarda veya diğer memeli hücrelerinde ferritinofajiyi değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
WIPI (fosfoinositidlerle WD-tekrar etkileşimi) proteinleri, otofaji1’de farklı rollere sahip evrimsel olarak korunmuş PI3P efektörleridir. Dört insan WIPI proteini (WIPI1’den WIPI4’e kadar), homolog ve değişmez amino asitlerin pervanenin zıt bölgelerinde kümelendiği evrimsel olarak korunmuş iki bölgeye sahip yedi kanatlı β pervanelere katlanır. Bir bölge, pervane kanadı 5 ve kanat 6’daki fosfoinositid bağlama bölgesi ile hizalanmıştır. Diğer bölge, WIPI’lerin otofaji mekanizmasının farklı üyeleri veya otofaji düzenleyici faktörler2 ile ilişkili olduğu protein-protein etkileşim bölgesi ile uyumludur.
WIPI4, enerji güdümlü otofaji düzenlemesini kontrol etmede ve büyüyen yeni ortaya çıkan otofagozom3’ün boyutunu kontrol etme düzeyinde işlev görür. WDR45 olarak adlandırılan WIPI4 genindeki bir mutasyon, insan hastalarda beyin demir birikimi (NBIA) alt tipine sahip bir nörodejenerasyon olan ve substantia nigra ve globus pallidus4’te hipointens bir demir halesi ile karakterize edilen beta-pervane ilişkili nörodejenerasyonun (BPAN) nedenidir. BPAN hastalarında anormal demir birikintilerinin varlığı, ensefalopati, küresel gelişimsel gecikme, nöbetler ve nihayetinde parkinsonizm, demans ve spastisiteye dönüşen nöronal hasara neden olur5.
Demir homeostazı, çoklu hücresel mekanizmalar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir, sitozolik demir konsantrasyonu, demir taşıyıcılarının, demir taşıyıcılarının ve demir depolama proteinlerininekspresyon seviyeleri ve işlevselliği tarafından kontrol edilir 6 . Sitozolik demir konsantrasyonu, sırayla, ferritinofaji7 veya oksitlenmiş ferritin8’in proteazomal klerensi gibi bozunma yollarının dahil olup olmadığını belirler.
Ferritinofaji sırasında, ferritin, kargo reseptörü NCOA4 tarafından seçici olarak otofagozomlara alınır ve düşük hücre içi demir seviyelerine7 yanıt olarak lizozomal bozunma için hedeflenir. WIPI4’ün otofagozomal membranların3 boyutunu düzenlemedeki rolü göz önüne alındığında, bu spesifik fonksiyonun kaybının, otofagozomlarda ferritinin seçici sekestrasyonunu ve dolayısıyla ferritinofajiyi etkileyebileceğini tahmin etmek mantıklıdır. Demir metabolizmasındaki bu önemli adımı incelemek, BPAN hastaları için terapötik seçeneklere kapı açabilir; Bununla birlikte, insan hücrelerinde ferritinofajiyi incelemek için yaygın olarak kullanılan protokoller ancak şu anda geliştirilmektedir.
Bu makale, insan hücrelerinde ferritinofajiyi değerlendirmek için yüksek verimli, floresan tabanlı bir yöntemi açıklamaktadır. Bu testin hastadan türetilen BPAN hücrelerine uygulanması, ferritinofajinin sağlıklı insan hücrelerine kıyasla nasıl farklılaştığına dair değerli bilgiler sağlayabilir ve bu nadir insan hastalığının altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir ölçüt görevi görebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anahtar ferritinofaji faktörlerinin hücre içi lokalizasyonunu değerlendirmek için açık erişimli CellProfiler tabanlı görüntü analizi9 ile birlikte otomatik floresan mikroskobu kullanan bu yöntem, ferritinofaji7 olarak adlandırılan seçici otofaji yoluyla lizozomal ferritin klerensinin etkinliği hakkında değerli bilgiler sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu protokol, aynı anda birden fazla hücre hattı ve muamelesi olan büyük numune setlerinin işlenmesini ve ferritinofaji akısını değerlendirmek için tipik bir lizozomal belirteç olan LAMP2 ile birlikte lokalize olan ferritin punkta sayıları ve ferritin punkta sayıları gibi istenen okumaların değerlendirilmesini sağlar. Bununla birlikte, burada, doğru, otomatik görüntü analizinin görüntü kalitesine bağlı olduğu ve bunun da antikor özgüllüğüne ve optimal görüntülemeye bağlı olduğu vurgulanmalıdır. Bu nedenle, yazılım tabanlı görüntü analizi yalnızca yüksek kaliteli görüntülerle yapılmalıdır.
Hücrelerdeki demir seviyelerinin modülasyonu, hastalık bağlamında demir homeostazını düzenlemek için aktive edilen mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu makale, demir yükleme ve demir şelatlama ajanları ile tedavi edilen hasta kaynaklı hücrelerde BPAN hastalıklarını incelemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Deferasiox (DFX),10 alanında yaygın olarak kullanılan bilinen bir demir şelatörüdür. Uygulandığında, serbest demiri sitoplazmada hapseder ve demir açlığına hücresel bir yanıtı tetikler. Bu çalışmanın amacı ferritinofajiyi değerlendirmek olduğundan, demir hücrelerini mahrum bırakmak, hücresel demir havuzunu yenilemek için bir kompanzasyon mekanizması olarak otofaji yoluyla ferritin bozulmasını teşvik etmenin basit bir yoluydu. Ferrik amonyum sitrat (FAC), aksine, hücreleri demir ile yüklemek için kullanılır. Hücreler, aşırı ve dolayısıyla toksik sitozolik demir konsantrasyonlarına bir yanıt olarak ferritin sentezini aktive eder11. Ferrik amonyum sitrat, bu nedenle, ferritin sentezini ve demirin ferritin heteropolimerleri içinde sıkışmasını teşvik eder ve bu da ferritinofajiyi aktive edebilir.
Ferritinofajik akıyı incelemek için, bu protokolde, süreçteki anahtar oyuncuları – ferritin ve lizozomları (burada LAMP2 ile işaretlenmiştir) seçici olarak boyayız ve bunların kolokalizasyonunu değerlendiriyoruz. Yüksek bir kolokalize punkta yüzdesi, ferritinin etkili lizozomal bozunmasının göstergesidir. Bu tür deneylerden elde edilen bilgileri en üst düzeye çıkarmak için ek boyalar veya işaretleyici antikorlar kullanılabilir.
Dikkat çekici bir şekilde, bu yöntemin doğasında teknik zorluklar vardır. Farklı insan donörlerinden türetilen primer fibroblastlar in vitro olarak çoğalabilir ve farklı şekilde büyüyebilir. Bu nedenle, karşılaştırılabilir sonuçlar için, aynı geçitte farklı hücreler tohumlanmalıdır. Bu nedenle, kullanılacak hücrelerin veya hücre hatlarının iki katına çıkma sürelerini incelemek için bu protokole devam etmeden önce bir test deneyi yapılması tavsiye edilir.
Bu yöntem ferritinofaji çalışması ile sınırlı değildir; Kullanılan tedavileri ve antikorları basitçe değiştirerek, diğer çeşitli seçici otofaji yollarını değerlendirmek için yeniden kullanılabilir; örneğin, mitofaji, mitokondriyal stres indükleyicisi olarak CCCP ve boyama12 için optineurin, LC3 ve LAMP2 antikorları kullanılarak incelenebilir.
Genel olarak, otomatik görüntü toplama ve CellProfiler analizinin kombinasyonu, tek insan fibroblastlarının yüksek verimli fonksiyonel değerlendirmesi için güçlü bir araç oluşturur. Bu, özellikle hastadan türetilmiş hücrelerin ve sağlıklı donörden türetilmiş hücrelerin büyük kohortlarının analizi ve karşılaştırılmasının büyük ilgi gördüğü insan hastalıklarının incelenmesi ile ilgilidir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) Projesi-ID 259130777 – SFB 1177 (proje E03) tarafından finanse edilmiştir. Şekil 1 , BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.
Materials
| Cell lines | |||
| Primary skin-derived human fibroblasts | Skin biopsy, healthy human donor, Biobank University Clinic Tübingen, Ethical approvement 389/2019BO2 | F-CO-60, passage 9 | |
| Cell culture treatments | Final concentration (compound) | ||
| Control medium | DMEM 10%FCS | (DMSO only) | |
| Control medium + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 100 nM bafilomycin A1 | |
| Control medium + deferasiox (DFX) | DMEM 10%FCS | 30 µM DFX | |
| Control medium + DFX + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 30 µM DFX, 100 nM bafilomycin A1 | |
| Control medium + ferric ammonium citrate (FAC) | DMEM 10%FCS | 0.05 mg/mL FAC | |
| Control medium + FAC + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 0.05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomycin A1 | |
| Material | |||
| Albumin [BSA] Fraction V | AppliChem | A1391 | |
| Alexa 488 goat a-rabbit | Life Technologies | A-11008 | |
| Alexa 546 goat a-mouse | Life Technologies | A-11003 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma Aldrich | 196000 | |
| BioLite Cell Culture treated 10cm dishes | Thermo Scientific | 130182 | |
| DAPI | AppliChem | A4099 | |
| Deferasiox (ICL-670) | Selleckchem | S1712 | |
| DMEM Glutamax | Gibco | 31966 | |
| DMSO | AppliChem | A3672 | |
| DPBS no calcium nor magnesium | Gibco | 14190094 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | |
| Ferric ammonium citrate (FAC) | Merck | F5879 | |
| Anti-FERRITIN (Human Spleen) | Rockland | 200-401-090-0100 | |
| LAMP2 (H4B4) | Santa Cruz | Sc-18822 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| PBS 10x Dulbecco’s | AppliChem | A0965 | |
| PenStrep (1,00U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) with phenol red | Gibco | 25300 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| 96 well glass-bottom #0 plates | Cellvis | P96-0-N | |
| Solution | |||
| 3.7% paraformaldehyde (PFA) | PFA dissolved in PBS, pH 7.5 | ||
| Bafilomycin A1 100 mM stock | Bafilomycin A1 diluted in DMSO | ||
| Ferric ammonium citrate (FAC) 100 mg/mL stock | FAC diluted in autoclaved double distilled water | ||
| PBS/T | PBS, supplemented with 10% Tween20 | ||
| PBS/T + BSA | PBS, supplemented with 10% Tween20, 1% BSA | ||
| Software | |||
| CellProfiler 4.2.4 | https://cellprofiler.org/ | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Microsoft Excel Version 16.50 | Microsoft Office Plus 365 |
References
- Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
- Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
- Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637 (2017).
- Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
- Wilson, J. A. -. O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
- Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
- Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
- Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
- Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
- Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
- Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).
