フェリチノファジー:ヒト線維芽細胞におけるオートファジーによる鉄の選択的分解の評価

1. 初代細胞の培養と播種 凍結した細胞の入ったバイアルを液体窒素タンクから取り出し、細胞培養室に到達するまで氷上に置いておきます。以前に滅菌したフードで、バイアルを手に持って細胞懸濁液を解凍します。細胞を再懸濁し、10%ウシ胎児血清(FCS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を含む9mLの予熱DMEMを入れた10cm細胞培養プレートに移します。細胞がプレート上に均一に分布するように穏やかに振とうし、37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートします 翌朝、細胞が付着していることを確認するために細胞を見てください。培地を新鮮なDMEM + 10% FCS + 1%P/Sに変更し、細胞が80%のコンフルエント度に達するまで増殖させます。 培地を取り出し、DPBSで2回洗浄し、1 mLのトリプシンをプレートに加え、37°Cおよび5%CO2 で10分間インキュベートします。9 mLのDMEM + 10% FCSをプレートに加え、細胞を再懸濁します。 細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。ノイバウアーチャンバーを使用して手動で細胞数を決定し、細胞濃度が40,000細胞/mLに達するまで、DMEM + 10% FCSで細胞懸濁液を希釈します。 ガラス底の96ウェルプレートで、細胞懸濁液の100 μL/ウェルを播種します。37°Cおよび5%CO2 で16時間インキュベートします。 2. 治療 材料表に従って、以下の処理を準備します:制御媒体、鉄キレート化用の制御培地とデフェラシオックス(DFX)、または鉄負荷用の制御培地とクエン酸第二鉄アンモニウム(FAC)です。フェリチノファジーフラックスの評価のために、リソソーム阻害剤(バフィロマイシンA1)の存在下と非存在下の両方ですべての治療を準備します。. プレートから培地を取り出し、対応する処理剤(100 μL/ウェル)と交換します。 37°Cおよび5%CO2 で6時間インキュベートします。 3. 固定・染色 処理媒体を吸引し、DPBS(Table of Materials)で2回洗浄します。 ウェルあたり100 μLの3.7%パラホルムアルデヒド(PFA、 Table of Materials)を添加します。細胞を室温で20分間、暗闇の中で固定します。 PFAを取り出し、PBS/T(Table of Materials)で細胞を2回洗浄します。 1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS/T中で、4°Cで1時間ブロックします。 一次抗体(材料表)をPBS/T(フェリチン抗体1:50、LAMP2抗体1:50)に混ぜて調製します。 細胞をPBS/Tで2回洗浄し、1ウェルあたり50μLの抗体ミックスをアプライします。プレートをパラフィルムで包み、4°Cで一晩インキュベートします。 翌朝、二次抗体(Table of Materials)ミックス(1:200)をPBS/Tで調製します。 細胞をPBS/Tで2回洗浄し、1ウェルあたり50 μLの二次抗体ミックスをアプライします。暗所で4°Cで1時間インキュベートします。 5 μg/μL 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、 材料表)溶液を室温PBSで調製します。 細胞をPBS/Tで2回洗浄し、DAPI染色液を100 μL/ウェル加えます。暗所で室温で20分間インキュベートします。 細胞をPBSで2回洗浄し、各ウェルに50μLのPBSを加えます。プレートをパラフィルムで包み、暗所で4°Cで保管します。 4. 共焦点レーザー走査型顕微鏡による自動イメージング プレート内のPBSを室温で50μLの新鮮なPBSと交換します。 プレートをアルミホイルで覆い、顕微鏡室に持って行きます。 共焦点レーザー走査型顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡テーブルに96ウェルプレート用のサンプルホルダーをセットし、適切な対物レンズ(ここでは40倍)を選択します。詳細については、 表 1 を参照してください。 イメージング設定を調整します(表1)。Smart Setupで、レーザーとフィルターを選択し、それらをトラック(トラック1〜3)に割り当てて、最適な画質と速度を実現します(表1)。 実験の種類を選択するときは、[タイル]をクリックして、プレート上の決定されたX、Y位置を選択して保存するオプションを有効にします。 イメージングセットアップモジュールで、集録チャンネル、それらに割り当てられたトラック、およびそれらの励起波長と発光波長を視覚化します(表1)。 Acquisition Modeモジュールで、以下を選択します。 Scan Speed: 6;方向:双方向;平均:2倍;ピクセルあたりのビット数: 8。 チャンネルモジュールで、各チャンネルのレーザー出力、ピンホール、マスターゲインを個別に調整します(表2)。これらのパラメータを微調整して、画像を飽和させすぎないように適切に露出します。 フォーカス戦略モジュールをクリックします。[ソフトウェア オートフォーカスとデフィニスト フォーカスを組み合わせる] を選択します。 [Reference Channel and Offsets] で、最も安定している/最も明るいチャンネルをリファレンスとして選択します (通常は DAPIまたは488 nm)。 安定化イベントの繰り返しと頻度(Stabilization Event Repetitions and Frequency)で、標準(Standard)を選択します。 ソフトウェアオートフォーカスモジュールで、次の項目を選択します。 強度;検索 |賢い;サンプリング |いい;相対範囲。 タイルモジュールをクリックします。[ポジション] | [シングル ポジション] を選択します。 [Advanced Setup]で、プレート内を移動し、イメージングの位置を特定し、[Position Setup]タブの[+]ボタンをクリックします。 各位置に、画像メタデータに記録される追加情報のラベルを付けます。これを行うには、[プロパティ]タブを開き、[カテゴリ]ドロップダウンメニューの横にあるホイールアイコンをクリックし、[新規]をクリックして、新しいカテゴリ名を入力する新しいダイアログボックスを開きます。特定のポジションにカテゴリーを割り当てるには、ポジションを選択し、[プロパティ]タブをクリックして、[カテゴリー]ドロップダウンメニューに移動し、対応するラベルを選択します。注:各処理のカテゴリを作成して、細胞が受けた処理で各位置にラベルを付けることをお勧めします。 [Sample Carrier]で、[Multiwell 96-Cellvis]ガラス底部#0を選択します。「キャリブレーション」をクリックして、マイクロスコープをプレート表面にキャリブレーションします。システムの仕様に応じて、1ポイントまたは7ポイントのキャリブレーションを選択します。 [オプション] で、タイルの重なりを 10% に選択します。[Tile Regions の移動] で、[コーム] を選択します。ステージ制御からステージ速度を使用する、ステージ制御からステージ加速度を使用する、および取得中に画像ピラミッドにチェックマークを付けます。 画像取得を実行し、画像結果(cziファイル)と画像メタデータ(csvファイル)をポータブルハードドライブに保存します。 画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。 5. ハイスループットな画像解析 6. データ分析 解析を実行した後、ソフトウェアが結果を含む一連の表形式テキスト ファイルを作成するのを待ちます。提供されている CellProfiler パイプライン (補足ファイル 1) を使用している場合は、次の出力ファイルを探します。CellProfilerOutputCells ファイルには、ソフトウェアによって割り当てられた画像番号、単一セルに割り当てられたセル番号、元のファイル名、ファイルの保存場所を示すパス、セルあたりの点数 (ferritin, LAMP2)、セルあたりの平均点面積 (ferritin, LAMP2) が一覧表示されます。 CellProfilerOutputExperiment ファイル: 実験に関連する技術的な詳細 (ソフトウェアのバージョン、画像チャネル、メタデータタグなど) に関する情報を提供します。 これらのファイルをスプレッドシートとして開きます。 優先統計ソフトウェア(Table of Materials)を使用して、puncta countsとpuncta共局在数の統計分析に進みます。