Ферритинофагия: оценка селективной деградации железа путем аутофагии в фибробластах человека
Summary
Этот протокол содержит подробные инструкции по проведению высокопроизводительной иммунофлуоресцентной оценки ферритинофагии в первичных фибробластах человека, полученных из кожи.
Abstract
Мутации в гене аутофагии WDR45/WIPI4 являются причиной бета-пропеллер-ассоциированной нейродегенерации (BPAN), подтипа заболеваний человека, известного как нейродегенерация с накоплением железа в мозге (NBIA) из-за наличия отложений железа в мозге пациентов. Внутриклеточный уровень железа жестко регулируется рядом клеточных механизмов, в том числе критическим механизмом ферритинофагии. В этой статье описывается, как можно оценить ферритинофагию в первичных фибробластах человека, полученных из кожи. В этом протоколе мы используем железомодулирующие условия для индукции или ингибирования ферритинофагии на клеточном уровне, такие как введение бафиломицина А1 для ингибирования функции лизосом и лечение цитратом железа аммония (FAC) или деферазиоксом (DFX) для перегрузки или истощения железа соответственно. Такие обработанные фибробласты затем подвергаются высокопроизводительной визуализации и количественному анализу локализации эндогенного ферритина и аутофагосомных/лизосомальных маркеров на основе CellProfiler, в данном случае LAMP2. На основании уровня аутофагосомного/лизосомального ферритина можно сделать выводы относительно уровня ферритинофагии. Этот протокол может быть использован для оценки ферритинофагии в первичных фибробластах пациента, полученных от BPAN, или других типах клеток млекопитающих.
Introduction
Белки WIPI (WD-повтор, взаимодействующие с фосфоинозитидами) являются эволюционно консервативными эффекторами PI3P с различными ролями в аутофагии1. Четыре человеческих белка WIPI (от WIPI1 до WIPI4) сворачиваются в семилопастные β-пропеллеры с двумя эволюционно консервативными областями, в которых гомологичные и инвариантные аминокислоты группируются на противоположных участках пропеллера. Один сайт выровнен с областью связывания фосфоинозитида в лопастях воздушного винта 5 и лопасти 6. Другой сайт выровнен с областью белок-белкового взаимодействия, где WIPI связываются с различными членами механизма аутофагии или регуляторными факторами аутофагии2.
WIPI4 функционирует в управлении регуляцией аутофагии, вызванной энергией, и на уровне контроля размера растущей зарождающейся аутофагосомы3. Мутация в гене WIPI4, называемом WDR45, является причиной бета-пропеллер-ассоциированной нейродегенерации (BPAN), нейродегенерации с подтипом накопления железа в мозге (NBIA) у пациентов, которая характеризуется гипоинтенсивным ореолом железа в черной субстанции и бледном шаре4. Наличие аномальных отложений железа у пациентов с BPAN провоцирует повреждение нейронов, что приводит к энцефалопатии, общей задержке развития, судорогам и, в конечном итоге, паркинсонизму, деменции испастичности.
Гомеостаз железа жестко регулируется многочисленными клеточными механизмами, при этом концентрация цитозольного железа контролируется уровнями экспрессии и функциональностью переносчиков железа, транспортеров железа и белков храненияжелеза. Концентрация цитозольного железа, в свою очередь, определяет, участвуют ли в этом пути деградации, такие как ферритинофагия7 или протеасомный клиренс окисленного ферритина8 .
Во время ферритинофагии ферритин избирательно рекрутируется в аутофагосомы карго-рецептором NCOA4 и нацелен на лизосомальную деградацию в ответ на низкий внутриклеточныйуровень железа. Учитывая роль WIPI4 в регуляции размера аутофагосомальных мембран3, разумно предположить, что потеря этой специфической функции может повлиять на селективную секвестрацию ферритина в аутофагосомах и, таким образом, на ферритинофагию. Изучение этого ключевого этапа метаболизма железа может открыть двери к терапевтическим возможностям для пациентов с BPAN; Тем не менее, широко используемые протоколы для изучения ферритинофагии в клетках человека только сейчас разрабатываются.
В данной статье описывается высокопроизводительный флуоресцентный метод оценки ферритинофагии в клетках человека. Применение этого анализа к клеткам BPAN, полученным от пациентов, может дать ценную информацию о том, как ферритинофагия отличается от здоровых клеток человека, и может послужить ориентиром для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этого редкого заболевания человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод, в котором используется автоматизированная флуоресцентная микроскопия в сочетании с открытым анализом изображений на основе CellProfiler9 для оценки внутриклеточной локализации ключевых факторов ферритинофагии, был разработан для получения ценной информации об эффективности лизосомального клиренса ферритина посредством селективной аутофагии, называемой ферритинофагией7. Этот протокол позволяет обрабатывать большие наборы образцов с несколькими клеточными линиями и обработками одновременно, а также оценивать желаемые показатели, такие как ферритиновые пунктирные числа и ферритиновые пункты, колокализуясь с LAMP2, который является типичным лизосомальным маркером для оценки потока ферритинофагии. Однако здесь следует подчеркнуть, что точный, автоматизированный анализ изображений зависит от качества изображения, которое, в свою очередь, зависит от специфичности антител и оптимальной визуализации. Поэтому программный анализ изображений должен выполняться только с изображениями высокого качества.
Модуляция уровня железа в клетках может предоставить ценную информацию о механизмах, которые активируются для регуляции гомеостаза железа в контексте заболевания. В данной работе описан метод изучения заболеваний BPAN в клетках пациента, обработанных железонагрузочными и хелатирующими агентами. Деферазиокс (DFX) является известным хелатором железа, широко используемым в полевых условиях10. При нанесении он захватывает свободное железо в цитоплазме и запускает клеточную реакцию на железное голодание. Поскольку целью данного исследования была оценка ферритинофагии, лишение клеток железа было прямым способом стимулирования деградации ферритина посредством аутофагии в качестве компенсационного механизма для пополнения клеточного пула железа. Цитрат железа и аммония (ФАК), наоборот, используется для нагружения элементов железом. Клетки активируют синтез ферритина в ответ на чрезмерные и, следовательно, токсичные концентрации цитозольного железа11. Цитрат железа и аммония, таким образом, способствует синтезу ферритина и удержанию железа в гетерополимерах ферритина, что, в свою очередь, может активировать ферритинофагию.
Для изучения ферритинофагического потока в этом протоколе мы селективно окрашиваем ключевых участников процесса — ферритин и лизосомы (здесь обозначены LAMP2) — и оцениваем их колокализацию. Высокий процент колокализующихся точек указывает на эффективную лизосомальную деградацию ферритина. Чтобы максимизировать информацию, полученную в результате таких экспериментов, можно использовать дополнительные красители или маркерные антитела.
Следует отметить, что этот метод сопряжен с техническими трудностями. Первичные фибробласты, полученные от разных доноров, могут пролиферировать и расти по-разному in vitro. Следовательно, для получения сопоставимых результатов, разные клетки должны быть засажены в одном и том же проходе. Поэтому рекомендуется провести тестовый эксперимент, прежде чем приступать к применению данного протокола, чтобы изучить время удвоения клеток или клеточных линий, которые будут использоваться.
Этот метод не ограничивается изучением ферритинофагии; Просто изменив методы лечения и используемые антитела, его можно перепрофилировать для оценки различных других селективных путей аутофагии; Например, митофагию можно исследовать, используя CCCP в качестве индуктора митохондриального стресса и антитела к оптинеринину, LC3 и LAMP2 для окрашивания12.
В целом, комбинация автоматического получения изображений и анализа с помощью CellProfiler представляет собой мощный инструмент для высокопроизводительной функциональной оценки отдельных фибробластов человека. Это особенно актуально для изучения заболеваний человека, для которых анализ и сравнение больших когорт клеток пациента и здоровых донорских клеток представляют большой интерес.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкое научно-исследовательское общество) Project-ID 259130777 – SFB 1177 (проект E03). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.
Materials
| Cell lines | |||
| Primary skin-derived human fibroblasts | Skin biopsy, healthy human donor, Biobank University Clinic Tübingen, Ethical approvement 389/2019BO2 | F-CO-60, passage 9 | |
| Cell culture treatments | Final concentration (compound) | ||
| Control medium | DMEM 10%FCS | (DMSO only) | |
| Control medium + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 100 nM bafilomycin A1 | |
| Control medium + deferasiox (DFX) | DMEM 10%FCS | 30 µM DFX | |
| Control medium + DFX + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 30 µM DFX, 100 nM bafilomycin A1 | |
| Control medium + ferric ammonium citrate (FAC) | DMEM 10%FCS | 0.05 mg/mL FAC | |
| Control medium + FAC + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 0.05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomycin A1 | |
| Material | |||
| Albumin [BSA] Fraction V | AppliChem | A1391 | |
| Alexa 488 goat a-rabbit | Life Technologies | A-11008 | |
| Alexa 546 goat a-mouse | Life Technologies | A-11003 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma Aldrich | 196000 | |
| BioLite Cell Culture treated 10cm dishes | Thermo Scientific | 130182 | |
| DAPI | AppliChem | A4099 | |
| Deferasiox (ICL-670) | Selleckchem | S1712 | |
| DMEM Glutamax | Gibco | 31966 | |
| DMSO | AppliChem | A3672 | |
| DPBS no calcium nor magnesium | Gibco | 14190094 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | |
| Ferric ammonium citrate (FAC) | Merck | F5879 | |
| Anti-FERRITIN (Human Spleen) | Rockland | 200-401-090-0100 | |
| LAMP2 (H4B4) | Santa Cruz | Sc-18822 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| PBS 10x Dulbecco’s | AppliChem | A0965 | |
| PenStrep (1,00U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) with phenol red | Gibco | 25300 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| 96 well glass-bottom #0 plates | Cellvis | P96-0-N | |
| Solution | |||
| 3.7% paraformaldehyde (PFA) | PFA dissolved in PBS, pH 7.5 | ||
| Bafilomycin A1 100 mM stock | Bafilomycin A1 diluted in DMSO | ||
| Ferric ammonium citrate (FAC) 100 mg/mL stock | FAC diluted in autoclaved double distilled water | ||
| PBS/T | PBS, supplemented with 10% Tween20 | ||
| PBS/T + BSA | PBS, supplemented with 10% Tween20, 1% BSA | ||
| Software | |||
| CellProfiler 4.2.4 | https://cellprofiler.org/ | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Microsoft Excel Version 16.50 | Microsoft Office Plus 365 |
References
- Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
- Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
- Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637 (2017).
- Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
- Wilson, J. A. -. O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
- Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
- Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
- Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
- Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
- Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
- Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).
