Ferritinophagie : évaluation de la dégradation sélective du fer par autophagie dans les fibroblastes humains

1. Culture et ensemencement de cellules primaires Récupérez le flacon contenant des cellules congelées dans le réservoir d’azote liquide et conservez-le sur de la glace jusqu’à ce qu’il atteigne la salle de culture cellulaire. Dans une hotte préalablement stérilisée, tenez le flacon dans la main pour que la suspension cellulaire décongèle. Remettre les cellules en suspension et les transférer dans une plaque de culture cellulaire de 10 cm contenant 9 ml de DMEM préchauffé avec 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Agiter doucement pour que les cellules se répartissent uniformément sur la plaque et incuber pendant une nuit à 37 °C et 5% de CO2 Le lendemain matin, examinez les cellules pour confirmer qu’elles sont attachées. Changez le milieu en DMEM frais + 10 % FCS + 1 % P/S, et laissez les cellules se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence. Retirer le milieu de culture, laver 2 fois avec du DPBS, ajouter 1 mL de trypsine dans la plaque et l’incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 10 min. Ajouter 9 mL de DMEM + 10 % de FCS dans la plaque et remettre les cellules en suspension. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml. Déterminez manuellement le nombre de cellules à l’aide d’une chambre Neubauer et diluez la suspension cellulaire dans du DMEM + 10 % de FCS jusqu’à ce qu’une concentration cellulaire de 40 000 cellules/ml soit atteinte. Dans une plaque à fond de verre à 96 puits, semer 100 μL/puits de suspension cellulaire. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 16 h. 2. Traitements Préparez les traitements suivants selon le tableau des matériaux : milieu témoin, milieu témoin plus déférasiox (DFX) pour la chélation du fer, ou milieu témoin plus citrate d’ammonium ferrique (FAC) pour la charge en fer. Préparer tous les traitements en présence et en l’absence d’un inhibiteur lysosomal (bafilomycine A1) pour l’évaluation du flux de ferritinophagie. Retirer le milieu de culture de la plaque et le remplacer par le traitement correspondant (100 μL/puits). Incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 6 h. 3. Fixation et coloration Aspirez le produit de traitement et lavez-le 2 fois avec du DPBS (Table of Materials). Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 3,7 % (PFA, Table des matériaux) par puits. Fixez les cellules pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Retirez le PFA et lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T (Table des matériaux). Bloc dans PBS/T contenant 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h à 4 °C. Préparez le mélange d’anticorps primaires (tableau des matériaux) dans PBS/T (anticorps de ferritine 1:50, anticorps LAMP2 1:50). Lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T et appliquez 50 μL du mélange d’anticorps par puits. Enveloppez les plaques de parafilm et laissez incuber toute la nuit à 4 °C. Le lendemain matin, préparez le mélange d’anticorps secondaires (1:200) dans du PBS/T. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T et appliquez 50 μL du mélange d’anticorps secondaires par puits. Incuber à 4 °C pendant 1 h dans l’obscurité. Préparer une solution de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS à température ambiante. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T et ajoutez 100 μL/puits de colorant DAPI. Incuber pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS et ajoutez 50 μL de PBS dans chaque puits. Enveloppez les plaques avec du parafilm et conservez-les à 4 °C dans l’obscurité. 4. Imagerie automatisée à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser Remplacez le PBS dans la plaque par 50 μL de PBS frais à température ambiante. Couvrez la plaque de papier d’aluminium et apportez-la à la salle de microscopie. Allumez le microscope confocal à balayage laser, placez un porte-échantillon pour les plaques à 96 puits sur la table du microscope et choisissez un objectif approprié (ici : 40x). Voir le tableau 1 pour plus de détails. Ajustez les paramètres d’imagerie (Tableau 1).Dans la configuration intelligente, sélectionnez les lasers et les filtres, puis affectez-les à des pistes (pistes 1 à 3) pour une qualité d’image et une vitesse optimales (Tableau 1). Lors de la sélection du type d’expérience, cliquez sur Tuiles pour activer l’option de sélection et d’enregistrement des positions X,Y déterminées sur la plaque. Dans le module Configuration de l’imagerie , visualisez les voies d’acquisition, les pistes qui leur sont attribuées et leurs longueurs d’onde d’excitation et d’émission (Tableau 1). Dans le module Mode d’acquisition, sélectionnez les éléments suivants : Vitesse de balayage : 6 ; Direction : bidirectionnelle ; Moyenne : 2x ; Bits par pixel : 8. Dans le module Canaux , ajustez la puissance du laser, le sténopé et le gain principal pour chaque canal individuellement (Tableau 2). Ajustez ces paramètres pour obtenir des images correctement exposées sans les sursaturer. Cliquez sur le module Focus stratégie .Sélectionnez Combiner l’autofocus logiciel et la mise au point définitive. Sous Canal de référence et décalages, sélectionnez le canal le plus stable/le plus lumineux comme référence (normalement DAPI ou 488 nm). Sous Répétitions et fréquence des événements de stabilisation, sélectionnez Standard. Dans le module Autofocus logiciel , sélectionnez les éléments suivants : Mode | Intensité; Recherche | Intelligent; Échantillonnage | Bien; Portée relative. Cliquez sur le module Tuiles .Sélectionnez Positions | positions uniques. Sous Configuration avancée, naviguez dans la plaque, identifiez une position pour l’imagerie et cliquez sur le bouton + sous l’onglet Configuration de la position . Étiquetez chaque position avec des informations supplémentaires qui seront enregistrées sur les métadonnées de l’image. Pour ce faire, ouvrez l’onglet Propriétés , cliquez sur l’icône de la roue à côté du menu déroulant Catégorie , puis cliquez sur Nouveau pour ouvrir une nouvelle boîte de dialogue dans laquelle le nom de la nouvelle catégorie doit être saisi. Pour attribuer une catégorie à une certaine position, sélectionnez-la, cliquez sur l’onglet Propriétés , allez dans le menu déroulant Catégories et sélectionnez l’étiquette correspondante.REMARQUE : Il est recommandé de créer une catégorie pour chaque traitement afin d’étiqueter chaque position avec le traitement auquel les cellules ont été soumises. Sous Support d’échantillons, sélectionnez Fond en verre Multiwell 96-Cellvis #0. Cliquez sur Calibrer pour calibrer le microscope à la surface de la plaque. Choisissez entre un étalonnage en 1 point ou en 7 points en fonction des spécifications du système. Sous Options, sélectionnez un chevauchement de tuiles de 10 %. Sous Déplacement dans les régions de mosaïques, sélectionnez Peigner. Cochez les cases suivantes : utiliser la vitesse de la platine à partir du contrôle de la platine, utiliser l’accélération de la platine à partir du contrôle de la platine et la pyramide d’image lors de l’acquisition. Exécutez l’acquisition d’images et enregistrez les résultats de l’image (fichiers czi) et les métadonnées de l’image (fichiers csv) sur un disque dur portable. Exportez les images sous forme de fichiers TIFF. 5. Analyse d’images à haut débit Créez un fichier de feuille de calcul de métadonnées distinct avec les colonnes suivantes : Position, Puits, Condition, Série et Ensemble. Les données appropriées pour remplir ces colonnes sont extraites du fichier de métadonnées d’origine provenant de la microscopie confocale à balayage laser. Téléchargez le logiciel open source CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases). Lancez CellProfiler 4.2.4 en double-cliquant et importez le pipeline CellProfiler (fichier supplémentaire 1) par glisser-déposer.REMARQUE : Retrouvez ci-dessous les étapes de compilation du pipeline CellProfiler (Fichier supplémentaire 1) pour la reconnaissance automatisée des fibroblastes à l’aide de la coloration DAPI (Module 1, reconnaissance des noyaux, voir Tableau 2) et de la fluorescence de fond dans les cellules uniques dérivées d’AF488 (Module 2, reconnaissance cellulaire, voir Tableau 2). La reconnaissance des puncta (appelés objets) est déterminée par la taille du puncta et l’intensité de la fluorescence puncta sur le bruit de fond (Module 3, reconnaissance puncta, voir le tableau 2). Enfin, en fonction des limites des cellules, les ponctualités reconnues par le logiciel sont attribuées aux cellules correspondantes (Attribuer des relations). Une description détaillée de la mise en œuvre d’un pipeline CellProfiler pour les études d’autophagie a été publiée précédemment9. De plus, le Tableau 2 contient les paramètres CellProfiler utilisés dans cette étude. De plus, le fichier supplémentaire 2 affiche le pipeline CellProfiler (fichier supplémentaire 1) avec des captures d’écran prises dans l’ordre et faisant référence aux modules détaillés dans le tableau 2. Avant d’adapter le pipeline CellProfiler (fichier supplémentaire 1), faites glisser et déposez des fichiers image .czi individuels ou un dossier contenant plusieurs fichiers image .czi dans le module Image . Personnalisez le pipeline de reconnaissance d’image. Dans le module Noms et types , remplacez le code c1-c3 par un code qui permet au logiciel d’identifier et de trier les images monocanal à analyser. Ajustez les paramètres de pipeline pour les modules IdentifyPrimaryObjects et IdentifySecondaryObjects en optimisant les entrées numériques dans les modules. Les valeurs utilisées dans cette étude sont présentées dans le tableau 2. Pour suivre les ajustements, sélectionnez l’option Mode de test en cliquant sur le bouton Démarrer le mode de test . Cliquez ensuite sur le bouton Étape entre les modules. Attendez que des fenêtres contextuelles (l’image d’entrée d’origine, les contours de reconnaissance dessinés sur l’image d’origine et le résultat de l’analyse) montrent comment une image serait analysée avec les paramètres qui viennent d’être saisis. Une fois le pipeline optimisé, terminez le mode test. Exécutez l’analyse en activant le mode de test de sortie, puis en cliquant sur le bouton Analyser les images . Une fois l’analyse terminée, vérifiez la précision de la détection des cellules et des points en comparant les images d’entrée avec les sorties de superposition (limites de cellules, points de contrôle) générées par CellProfiler. Si elles ne sont pas satisfaisantes, ajustez les valeurs numériques dans les différents modules (tableau 2) jusqu’à ce que le résultat de l’analyse soit suffisamment précis. 6. Analyse des données Après avoir exécuté l’analyse, attendez que le logiciel crée un ensemble de fichiers texte tabulaires avec les résultats. Si vous utilisez le pipeline CellProfiler fourni (fichier supplémentaire 1), recherchez les fichiers de sortie suivants :Le fichier CellProfilerOutputCells , qui répertorie le numéro d’image attribué par le logiciel, le numéro de cellule attribué aux cellules individuelles, le nom du fichier d’origine et le chemin d’accès indiquant l’emplacement de stockage des fichiers, le nombre de points (ferritine, LAMP2) par cellule et la zone moyenne des points (ferritine, LAMP2) par cellule. Le fichier CellProfilerOutputExperiment , qui fournit des informations sur les détails techniques liés à l’expérience (par exemple, la version du logiciel, les canaux d’image, les balises de métadonnées). Ouvrez ces fichiers sous forme de feuilles de calcul. Procéder à l’analyse statistique des dénombrements ponctuels et des nombres de colocalisation ponctuels à l’aide du logiciel de statistiques préféré (Table des matériaux).