Ferritinophagie: Bewertung des selektiven Abbaus von Eisen durch Autophagie in humanen Fibroblasten
Summary
Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für die Durchführung von Immunfluoreszenz-basierten Ferritinophagie-Bewertungen mit hohem Durchsatz in primären, aus der Haut stammenden menschlichen Fibroblasten.
Abstract
Mutationen im Autophagie-Gen WDR45/WIPI4 sind die Ursache für die Beta-Propeller-assoziierte Neurodegeneration (BPAN), eine Unterform menschlicher Krankheiten, die aufgrund des Vorhandenseins von Eisenablagerungen im Gehirn von Patienten als Neurodegeneration mit Eisenakkumulation im Gehirn (NBIA) bekannt ist. Der intrazelluläre Eisenspiegel wird durch eine Reihe von zellulären Mechanismen, einschließlich des kritischen Mechanismus der Ferritinophagie, streng reguliert. In dieser Arbeit wird beschrieben, wie die Ferritinophagie in primären, aus der Haut stammenden humanen Fibroblasten bestimmt werden kann. In diesem Protokoll verwenden wir eisenmodulierende Bedingungen zur Induktion oder Hemmung der Ferritinophagie auf zellulärer Ebene, wie z. B. die Verabreichung von Bafilomycin A1 zur Hemmung der Lysosomenfunktion und die Behandlung von Eisenammoniumcitrat (FAC) oder Deferasiox (DFX) zur Überlastung bzw. Depletion von Eisen. Solche behandelten Fibroblasten werden dann einer Hochdurchsatz-Bildgebung und einer CellProfiler-basierten quantitativen Lokalisierungsanalyse von endogenem Ferritin und autophagosomalen/lysosomalen Markern, hier LAMP2, unterzogen. Ausgehend von der Höhe des autophagosomalen / lysosomalen Ferritins können Rückschlüsse auf den Grad der Ferritinophagie gezogen werden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Ferritinophagie in primären Fibroblasten von BPAN-Patienten oder anderen Arten von Säugetierzellen zu beurteilen.
Introduction
Die WIPI-Proteine (WD-repeat interacting with phosphoinositides) sind evolutionär konservierte PI3P-Effektoren mit unterschiedlichen Rollen in der Autophagie1. Die vier humanen WIPI-Proteine (WIPI1 bis WIPI4) falten sich zu siebenblättrigen β-Propellern mit zwei evolutionär konservierten Regionen, in denen sich homologe und invariante Aminosäuren an gegenüberliegenden Stellen des Propellers ansammeln. Eine Stelle ist mit der Phosphoinositid-Bindungsregion in den Propellerblättern 5 und 6 ausgerichtet. Die andere Stelle ist mit der Protein-Protein-Interaktionsregion ausgerichtet, in der WIPIs mit unterschiedlichen Mitgliedern der Autophagie-Maschinerie oder Autophagie-Regulationsfaktoren assoziieren2.
WIPI4 steuert die energiegetriebene Autophagie-Regulation und steuert die Größe des wachsenden entstehenden Autophagosoms3. Eine Mutation im WIPI4-Gen , die als WDR45 bezeichnet wird, ist ursächlich für die Beta-Propeller-assoziierte Neurodegeneration (BPAN), eine Neurodegeneration mit Gehirneisenakkumulation (NBIA) bei menschlichen Patienten, die durch einen hypointensen Eisenhalo in der Substantia nigra und dem Globus pallidus4 gekennzeichnet ist. Das Vorhandensein abnormaler Eisenablagerungen bei BPAN-Patienten provoziert neuronale Schäden, die sich in Enzephalopathie, globaler Entwicklungsverzögerung, Krampfanfällen und schließlich Parkinsonismus, Demenz und Spastik niederschlagen5.
Die Eisenhomöostase wird durch mehrere zelluläre Mechanismen streng reguliert, wobei die Konzentration von zytosolischem Eisen durch die Expressionsniveaus und die Funktionalität von Eisenträgern, Eisentransportern und Eisenspeicherproteinen gesteuert wird6 . Die Konzentration von zytosolischem Eisen wiederum bestimmt, ob Abbauwege wie die Ferritinophagie7 oder die proteasomale Clearance von oxidiertem Ferritin8 beteiligt sind.
Während der Ferritinophagie wird Ferritin vom Frachtrezeptor NCOA4 selektiv an Autophagosomen rekrutiert und als Reaktion auf niedrige intrazelluläre Eisenspiegel gezielt lysosomal abgebaut7. Angesichts der Rolle von WIPI4 bei der Regulierung der Größe von autophagosomalen Membranen3 ist es vernünftig vorherzusagen, dass der Verlust dieser spezifischen Funktion die selektive Sequestrierung von Ferritin in Autophagosomen und damit die Ferritinophagie beeinflussen kann. Die Untersuchung dieses wichtigen Schritts im Eisenstoffwechsel könnte BPAN-Patienten die Türen zu therapeutischen Optionen öffnen. Gängige Protokolle zur Untersuchung der Ferritinophagie in menschlichen Zellen werden jedoch erst jetzt entwickelt.
In dieser Arbeit wird eine fluoreszenzbasierte Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Ferritinophagie in humanen Zellen beschrieben. Die Anwendung dieses Assays auf von Patienten stammende BPAN-Zellen kann wertvolle Erkenntnisse darüber liefern, wie sich die Ferritinophagie im Vergleich zu gesunden menschlichen Zellen unterscheidet, und kann als Maßstab für das Verständnis der molekularen Mechanismen dienen, die dieser seltenen menschlichen Krankheit zugrunde liegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode, die automatisierte Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit einer frei zugänglichen CellProfiler-basierten Bildanalyse9 verwendet, um die intrazelluläre Lokalisation wichtiger Ferritinophagiefaktoren zu beurteilen, wurde entwickelt, um wertvolle Informationen über die Wirksamkeit der lysosomalen Ferritin-Clearance über selektive Autophagie, die als Ferritinophagie bezeichnet wird, zu liefern7. Dieses Protokoll ermöglicht die Handhabung großer Probensätze mit mehreren Zelllinien und Behandlungen gleichzeitig und die Beurteilung gewünschter Messwerte, wie z. B. Ferritin-Puncta-Zahlen und Ferritin-Puncta-Zahlen, die mit LAMP2 kolokalisiert sind, einem typischen lysosomalen Marker zur Beurteilung des Ferritinophagie-Flusses. Allerdings sollte hier betont werden, dass eine genaue, automatisierte Bildanalyse von der Bildqualität abhängt, die wiederum von der Antikörperspezifität und der optimalen Bildgebung abhängt. Daher sollte eine softwarebasierte Bildanalyse nur mit qualitativ hochwertigen Bildern durchgeführt werden.
Die Modulation des Eisenspiegels in Zellen kann wertvolle Informationen über die Mechanismen liefern, die aktiviert werden, um die Eisenhomöostase im Rahmen von Krankheiten zu regulieren. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung von BPAN-Erkrankungen in patienteneigenen Zellen beschrieben, die mit eisenbeladenden und eisenchelatbildenden Wirkstoffen behandelt wurden. Deferasiox (DFX) ist ein bekannter Eisenchelator, der in großem Umfang im Feld eingesetztwird 10. Nach der Anwendung schließt es das freie Eisen im Zytoplasma ein und löst eine zelluläre Reaktion auf Eisenmangel aus. Da das Ziel dieser Studie darin bestand, die Ferritinophagie zu bewerten, war der Entzug des Eisens den Zellen ein einfacher Weg, um den Ferritinabbau durch Autophagie als Kompensationsmechanismus zur Wiederauffüllung des zellulären Eisenpools zu fördern. Eisenammoniumcitrat (FAC) hingegen wird verwendet, um Zellen mit Eisen zu beladen. Zellen aktivieren die Ferritinsynthese als Reaktion auf zu hohe und damit toxische zytosolische Eisenkonzentrationen11. Eisenammoniumcitrat fördert daher die Ferritinsynthese und den Einschluss von Eisen in den Ferritin-Heteropolymeren, was wiederum die Ferritinophagie aktivieren kann.
Um den ferritinophagischen Fluss zu untersuchen, färben wir in diesem Protokoll selektiv die Hauptakteure im Prozess – Ferritin und die Lysosomen (hier markiert durch LAMP2) – und beurteilen ihre Kolokalisation. Ein hoher Prozentsatz an kolokalisierenden Punkta ist ein Hinweis auf einen effektiven lysosomalen Abbau von Ferritin. Um die aus solchen Experimenten gewonnenen Informationen zu maximieren, können zusätzliche Farbstoffe oder Marker-Antikörper verwendet werden.
Zu beachten ist, dass diese Methode technische Herausforderungen mit sich bringt. Primäre Fibroblasten, die von verschiedenen menschlichen Spendern stammen, können sich in vitro vermehren und unterschiedlich wachsen. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, sollten daher verschiedene Zellen an der gleichen Passage ausgesät werden. Daher ist es ratsam, vor Beginn dieses Protokolls ein Testexperiment durchzuführen, um die Verdopplungszeiten der zu verwendenden Zellen oder Zelllinien zu untersuchen.
Diese Methode ist nicht auf die Untersuchung der Ferritinophagie beschränkt; Durch einfaches Ändern der verwendeten Behandlungen und Antikörper kann es zur Bewertung verschiedener anderer selektiver Autophagiewege umfunktioniert werden. Zum Beispiel kann die Mitophagie untersucht werden, indem CCCP als mitochondrialer Stressinduktor und Optineurin-, LC3- und LAMP2-Antikörper für die Färbungverwendet werden 12.
Insgesamt stellt die Kombination aus automatisierter Bildaufnahme und CellProfiler-Analyse ein leistungsfähiges Werkzeug für die funktionelle Bewertung einzelner humaner Fibroblasten im Hochdurchsatz dar. Dies ist besonders relevant für die Untersuchung menschlicher Krankheiten, für die die Analyse und der Vergleich großer Kohorten von Patientenzellen und gesunden Spenderzellen von großem Interesse sind.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Projekt-ID 259130777 – SFB 1177 (Projekt E03). Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.
Materials
| Cell lines | |||
| Primary skin-derived human fibroblasts | Skin biopsy, healthy human donor, Biobank University Clinic Tübingen, Ethical approvement 389/2019BO2 | F-CO-60, passage 9 | |
| Cell culture treatments | Final concentration (compound) | ||
| Control medium | DMEM 10%FCS | (DMSO only) | |
| Control medium + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 100 nM bafilomycin A1 | |
| Control medium + deferasiox (DFX) | DMEM 10%FCS | 30 µM DFX | |
| Control medium + DFX + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 30 µM DFX, 100 nM bafilomycin A1 | |
| Control medium + ferric ammonium citrate (FAC) | DMEM 10%FCS | 0.05 mg/mL FAC | |
| Control medium + FAC + bafilomycinA1 | DMEM 10%FCS | 0.05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomycin A1 | |
| Material | |||
| Albumin [BSA] Fraction V | AppliChem | A1391 | |
| Alexa 488 goat a-rabbit | Life Technologies | A-11008 | |
| Alexa 546 goat a-mouse | Life Technologies | A-11003 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma Aldrich | 196000 | |
| BioLite Cell Culture treated 10cm dishes | Thermo Scientific | 130182 | |
| DAPI | AppliChem | A4099 | |
| Deferasiox (ICL-670) | Selleckchem | S1712 | |
| DMEM Glutamax | Gibco | 31966 | |
| DMSO | AppliChem | A3672 | |
| DPBS no calcium nor magnesium | Gibco | 14190094 | |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | |
| Ferric ammonium citrate (FAC) | Merck | F5879 | |
| Anti-FERRITIN (Human Spleen) | Rockland | 200-401-090-0100 | |
| LAMP2 (H4B4) | Santa Cruz | Sc-18822 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| PBS 10x Dulbecco’s | AppliChem | A0965 | |
| PenStrep (1,00U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) with phenol red | Gibco | 25300 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| 96 well glass-bottom #0 plates | Cellvis | P96-0-N | |
| Solution | |||
| 3.7% paraformaldehyde (PFA) | PFA dissolved in PBS, pH 7.5 | ||
| Bafilomycin A1 100 mM stock | Bafilomycin A1 diluted in DMSO | ||
| Ferric ammonium citrate (FAC) 100 mg/mL stock | FAC diluted in autoclaved double distilled water | ||
| PBS/T | PBS, supplemented with 10% Tween20 | ||
| PBS/T + BSA | PBS, supplemented with 10% Tween20, 1% BSA | ||
| Software | |||
| CellProfiler 4.2.4 | https://cellprofiler.org/ | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Microsoft Excel Version 16.50 | Microsoft Office Plus 365 |
References
- Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
- Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
- Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637 (2017).
- Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
- Wilson, J. A. -. O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
- Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
- Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
- Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
- Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
- Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
- Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).
