Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

Os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Academia Real de Artes e Ciências dos Países Baixos (KNAW) sob a licença do projeto AVD8010020151. Os organoides foram derivados de material excedente de camundongos. As biópsias da glândula lacrimal humana foram coletadas do material residual de pacientes submetidos à cirurgia no University Medical Centre Utrecht (UMCU) após aprovação pelo comitê de ética médica sob o protocolo número 18-740. O protocolo contém várias seções que são descritas na Figura 1. Figura 1: Visão geral do protocolo. Esta figura destaca as diferentes etapas do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. NOTA: Todas as composições de meio e tampão estão descritas na Tabela Suplementar 1. 1. Estabelecimento de organoides de glândulas lacrimais humanas e de camundongos Dissecando a glândula lacrimal de camundongoPrepare as ferramentas de dissecção, incluindo tesouras, pinças e almofadas de dissecção. Eutanásia de camundongos por inalação de O 2/CO2 13. Coloque o rato eutanasiado em seu abdômen sobre a almofada de dissecção e fixe seus membros. Molhe os cabelos localizados entre as orelhas dos camundongos e na testa com etanol 70%. Usando tesoura de dissecção, faça uma abertura atrás do crânio entre as orelhas. Estenda essa abertura sobre a testa até o nariz. Ainda usando tesoura, corte a pele atrás das orelhas para gerar dois retalhos. Tracionar os retalhos em direção ao nariz com firmeza até que as glândulas lacrimais fiquem expostas, como mostra a Figura 2A. Fixar os retalhos na placa de dissecção. Usando tesoura, faça uma pequena incisão na membrana localizada acima da glândula lacrimal para expor completamente a glândula lacrimal. Usando a pinça, puxe a glândula lacrimal. Deve haver alguma resistência até que o ducto lacrimal principal seja rompido. Se preferir, corte o ducto lacrimal principal diretamente com tesoura. Coloque a glândula lacrimal de camundongo em PBS de grau de cultura de tecido até processamento adicional. Prossiga com o processamento da glândula lacrimal dentro de 2-4 h para limitar a morte celular. Se isso demorar mais, colocar a glândula lacrimal de camundongo no meio de coleta de biópsia (Tabela Suplementar 1).NOTA: Várias glândulas lacrimais podem ser agrupadas se um grande número de organoides for necessário imediatamente. Coleta de biópsias da glândula lacrimal humanaAntes da cirurgia, preparar alíquotas de 20 mL do meio de coleta da biópsia (Tabela Suplementar 1) em um tubo de 50 mL, e entregá-las ao cirurgião antes da cirurgia. Este meio pode ser mantido a 4 °C por vários meses. No dia da cirurgia, deixar o cirurgião colher amostra de um pedaço da glândula lacrimal (geralmente <1 mm3) e guardá-lo no meio de coleta da biópsia (Tabela Suplementar 1) a 4 °C. Coletar a biópsia para processá-la o mais rápido possível. Idealmente, isso deve ser no mesmo dia dentro de 2 h após a amostragem da biópsia. Derivação organoidePreparar com antecedência: matriz extracelular (MEC) descongelada, camundongo à temperatura ambiente (TR) ou meio de expansão humana (Tabela Suplementar 1), colagenase descongelada, meio base (Tabela Suplementar 1), dois bisturis, uma placa de Petri de 10 cm, um filtro de 70 μm instalado em um tubo de 15 mL e placas de suspensão de 12 poços pré-aquecidas a 37 °C por 30 min. Preparar o meio de digestão combinando todos os componentes mostrados na Tabela Suplementar 1. Pré-molhe os bisturis neste meio para evitar que pedaços de tecido grudem neles. Recupere o tecido da glândula lacrimal humana ou do rato do meio e coloque-o na placa de Petri. Usando os bisturis pré-molhados, pique o tecido. Quando os pedaços de tecido forem muito pequenos (ou seja, <0,5 mm3), coloque-os no meio de digestão, raspando-os da placa de Petri com o bisturi. Se a biópsia humana já for muito pequena, coloque-a diretamente no meio de digestão sem picar para evitar a perda de tecido. Incubar os pedaços de tecido por até 15 min em banho-maria a 37 °C. Inverter o tubo de 15 mL regularmente para ressuspender as peças. Monitore a dissociação celular sob um microscópio de bancada para não digerir excessivamente o tecido. Enquanto isso, reduza uma pipeta Pasteur colocando sua ponta em uma chama enquanto gira, e pré-molhe-a no meio de base. Para dissociar eficientemente o tecido, certifique-se de que o orifício seja ligeiramente menor do que os maiores pedaços de tecido restantes. Para facilitar o processo de dissociação, pipete a mistura para cima e para baixo a cada 5 min com a pipeta estreitada pré-molhada de Pasteur. Quando muitas células isoladas e pequenos aglomerados são visíveis ao microscópio, pare a dissociação adicionando 10 mL do meio base. Gire para baixo a 400 x g por 5 min para pellet as células. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL do meio base para repetir a lavagem. Filtrá-lo através de um filtro de 70 μm para remover os grandes pedaços de tecido não digeridos e as fibras colágenas remanescentes, o que impediria a polimerização adequada da MEC. Gire o eluato a 400 x g por 5 min.NOTA: Uma pastilha de glóbulos vermelhos indica a presença de glóbulos vermelhos, o que normalmente não dificulta a derivação organoide. No entanto, para algumas aplicações, como citometria de fluxo, as hemácias devem ser lisadas. Para isso, incubar as células em 5 mL de tampão de lise de hemácias frescas em TR por 5 min, e pellet as células a 400 x g por 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 100 μL de MEC fria para uma única glândula lacrimal de camundongo e em 50 μL de MEC fria para uma biópsia humana. Ao ressuspender, tenha cuidado para não fazer bolhas, pois elas também afetariam a polimerização e a estabilidade da MEC. Semeando até 100 μL de células por poço de uma placa de suspensão de 12 poços. Use um P200 para fazer ~20 gotículas μL no poço. Quanto menores as gotículas, melhor a difusão dos fatores de crescimento e nutrientes através da matriz. Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora umidificada a 37 °C por 20-30 min para permitir que o ECM se solidifique. Uma vez que a MEC esteja solidificada, adicione ~1 mL de camundongo RT ou meio de expansão humano por poço de uma placa de 12 poços. Refrescar o meio a cada 2-3 dias até que os organoides atinjam um tamanho de 300 μm. Para isso, aspirar o meio no poço e adicionar suavemente o meio de expansão na lateral do poço sem tocar nas gotículas de ECM para não atrapalhá-las.NOTA: Primocina (100 mg/mL; 1:1.000 de estoque comercial) pode ser adicionada após o isolamento se ocorrer contaminação bacteriana. No entanto, porque retarda o crescimento organoide também, é preferível não adicioná-lo ou removê-lo após uma ou duas passagens. 2. Expansão dos organoides da glândula lacrimal humana e do camundongo Após ~7 dias para organoides de camundongos e ~10 dias para organoides humanos, quando os organoides atingirem um tamanho de ~300 μm, remova o meio de cultura. Ressuspender as gotículas de MEC contendo os organoides em 1 mL de solução de tripsina, pipetando vigorosamente para cima e para baixo com uma P1.000 até que as gotículas se desmoronem. Transfira essa mistura para um tubo de 15 mL e incube-a brevemente em banho-maria a 37 °C. Após 2-3 min, use uma pipeta de Pasteur estreitada e pré-molhada para pipetar a suspensão organoide para cima e para baixo 10x-15x. Verificar o estado de dissociação dos organoides sob um microscópio de bancada; pequenos aglomerados de ~20 células devem ser obtidos. Incubar por mais tempo em banho-maria a 37 °C e repetir a etapa de pipetagem até que a dissociação seja satisfatória.NOTA: Esta etapa pode levar mais tempo para organoides humanos, pois eles são multicamadas. Células únicas serão geradas; Isso não afeta o crescimento organoidal, desde que a maior parte da suspensão organoide consista em pequenos aglomerados. Interromper a dissociação adicionando 10 mL do meio base. Em seguida, pastilha as células a 400 x g por 5 min. Após a remoção do sobrenadante e da MEC que pode estar sobre os organoides (camada gelatinosa transparente e sem organoides), ressuspenda as células em um volume apropriado de MEC fria antes de plaquear em uma placa de suspensão, conforme indicado no passo 1.3.10.NOTA: Geralmente, os organoides lacrimais de camundongos são divididos em uma proporção de 1:5 e os organoides humanos em uma proporção de 1:3. Isso significa que, ao iniciar com organoides contidos em 100 μL de MEC, eles precisam ser ressuspensos em 500 μL e 300 μL, respectivamente, após a divisão. Incubar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 °C até a solidificação da MEC por 30 min e cobrir os organoides com o camundongo ou meio de expansão humano em RT. 3. Criopreservação dos organoides da glândula lacrimal humana e de camundongos Para criopreservar os organoides, primeiro divida os organoides no meio de expansão de acordo com as instruções dadas na seção 2. Cerca de 3-4 dias depois, quando os organoides estiverem em fase de crescimento, remova o meio e ressuspenda 100 μL da MEC contendo organoides em 10 mL de meio base fria. Incubar no gelo por 10 min para ajudar a dissociar a MEC. Vire o tubo regularmente para facilitar esse processo. Pellet os organoides a 500 x g por 5 min. Retirar o sobrenadante e ressuspender o organoide em 1 mL de meio de criopreservação (a sobra da MEC não prejudica a criopreservação). Transfira a suspensão organoide para um criovial e imediatamente para um congelador de −80 °C.NOTA: Ao usar o meio de criopreservação descrito na Tabela de Materiais, os crióvios podem ser mantidos indefinidamente em um freezer de −80 °C. Se outro meio de criopreservação for usado, transfira o criovial para um tanque de nitrogênio líquido após 24 h para garantir a preservação ideal. Para descongelar os organoides, retire o criovial do congelador e transporte-o em gelo seco para um banho-maria a 37 °C. Segure o criovial na água até que a maior parte do seu conteúdo esteja descongelado. Transfira o conteúdo para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio base e gire as células a 400 x g por 5 min. Placatear os organoides em 100 μL de MEC com o meio de expansão, conforme descrito nas etapas 2.5 e 2.6. 4. Diferenciar organoides da glândula lacrimal e avaliar sua funcionalidade Diferenciação organoidePara diferenciar organoides da glândula lacrimal, primeiro divida os organoides no meio de expansão de acordo com as instruções na seção 2. Após 2 dias, substituir o meio de expansão por meio de diferenciação rato ou humano, conforme descrito no passo 1.3.12. Atualize o meio a cada 2-3 dias para manter os organoides do rato por 5 dias nesse meio e os organoides humanos por 9 dias. Para avaliar a diferenciação organoide após 5 ou 9 dias no meio de diferenciação, coletar 100 μL de MEC contendo organoides para extrair o RNA. Para tanto, ressuspenda as gotículas da MEC em 1 mL de meio contido no poço com P1.000 e transfere a suspensão organoide em 3 mL de meio base gelado. Pellet os organoides a 500 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em tampão de extração de RNA. Realizar a extração de RNA a jusante de acordo com as instruções do kit de extração de RNA. Use o RNA obtido, por exemplo, para análise RT-qPCR da expressão de células-tronco (TP63, KRT5, KRT14) e marcadores celulares diferenciados (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2…) 14º.NOTA: Para obter a análise de expressão relevante, meça a expressão dos marcadores escolhidos em uma ou várias amostras de tecido. Organoides cultivados em condições de diferenciação tendem a conter menos RNA. Ensaio de inchamento funcionalNOTA: Para esta parte do protocolo, use organoides da glândula lacrimal humana que tenham sido diferenciados por pelo menos 7 dias. O tempo mínimo necessário é de 7 dias para garantir expressão suficiente do marcador para o lacrimejamento funcional. Cada poço de uma placa de 12 poços constitui uma condição. O número mínimo de condições é três: um controle positivo, um controle negativo e uma condição de teste.Preparar na hora 1 mL de meio de diferenciação humana contendo componentes individuais que induzem a secreção pelos organoides da glândula lacrimal. Por exemplo, adicione 100 μM de noradrenalina e 1 μM de forskolina, e misture bem.NOTA: Forskolin serve como um controle positivo que geralmente induz o inchaço máximo. Em um microscópio de lapso de tempo de campo claro automatizado, defina as posições a serem obtidas na placa, o intervalo de tempo (5 min) e a duração (4 h). Certifique-se de que uma gota inteira de ECM esteja visível em cada posição. Imediatamente antes de iniciar a obtenção de imagens e sem mover a placa do microscópio, retire o meio de cultura dos poços que serão fotografados e substitua-o pelo meio bem ressuspendido preparado na etapa 4.2.1. Incluir como controle negativo um poço com meio de diferenciação substituído apenas por meio de diferenciação, pois o refresco médio pode desencadear algum inchaço organoide. Após até 4 h, o ensaio de inchaço termina. Analise os resultados.NOTA: Essas etapas são executadas com um microscópio EVOS M7000 que permite imagens automatizadas de lapso de tempo de campo brilhante. Para esse microscópio, consulte o manual detalhado do fabricante para configurar a imagem de lapso de tempo. Vale ressaltar que qualquer outro microscópio com características semelhantes pode ser usado. Para quantificar o inchaço organoide, meça o diâmetro de cada organoide individual em 0 h e 4 h. Abra as imagens de uma única gota organoide a 0 h e 4 h no ImageJ. Clique no ícone Linha reta na barra de ferramentas e primeiro desenhe o diâmetro de um organoide em 0 h. Em seguida, use a ferramenta Medir no ImageJ (Analyze > Measure) para medir o comprimento dessa linha e, portanto, o diâmetro do organoide antes do inchaço. Repita o processo no mesmo organoide em 4 h para obter o diâmetro do organoide após o inchaço. Meça o diâmetro organoide de ~20 organoides por condição antes e depois do ensaio de inchaço. 5. Construindo um plasmídeo para nocautear Pax6 Projeto de gRNA para nocaute Pax6 usando editores de base C > TNOTA: Há uma abundância de programas de software disponíveis para o design de gRNA. Aqui, o Benchling foi usado, pois isso permite o design integrado de gRNA, anotação e o alinhamento dos traços de Sanger. Todas as etapas subsequentes podem, portanto, também ser realizadas usando programas de software alternativos.Inicie o processo de design de gRNA visualizando o gene alvo no Benchling clicando em Nova (+) > Sequência de DNA > Importar Sequências de DNA. Na guia Importar do Banco de Dados, digite o gene de interesse, Pax6, e pressione Pesquisar. Selecione a compilação mais recente do genoma de referência do mouse GRCm38 (mm10, Mus musculus) e pressione Importar. Selecione o éxon onde o gRNA nocaute pode ser projetado aderindo às seguintes regras:Evite colocar um gRNA no primeiro éxon codificador, porque locais de início alternativos em éxons subsequentes podem ser usados pela célula para contornar o códon de parada induzido precocemente. Projetar gRNAs em éxons que estão presentes em todos os transcritos alternativos que podem ocorrer por splicing do mRNA Pax6 . Para garantir isso, visualize Pax6 no navegador do genoma Ensembl e selecione o exon que é usado em todas as transcrições. Para contornar ainda mais o splicing alternativo, mire um éxon que tenha um códon incompleto (uma ou duas bases restantes de um triplete). Isso é de menor importância, mas dá mais certeza sobre os efeitos dos indels induzidos. Para a Pax6, o exon 4 ao exon 11 são um bom alvo. Além disso, escolha um éxon que contenha resíduos de triptofano (W), glutamina (Q) ou arginina (R).NOTA: Os editores de base C > T padrão que usam SpCas9 têm uma janela de edição que se estende do nucleotídeo 4 ao nucleotídeo 8 desde o início do gRNA (mais distante do PAM). Os editores de base C > T podem introduzir códons de parada em todos os resíduos de triptofano (W) (TGG para TGA, TAG ou TAA) com um gRNA na fita reversa, em resíduos de glutamina (Q) (CAG para TAG ou CAA para TAA) e, por último, em resíduos de arginina (R) (CGA para TGA) na fita direta. Selecione o exon + 20 bases upstream e downstream. Clique no lado direito da tela no sinal de destino CRISPR e clique em Projetar e analisar guias. No menu recém-aberto, na aba Design Type, marque os Guias para “edição base” (Komor et al., 2016). Mantenha o comprimento do guia em 20 nucleotídeos e, em Genoma para mouse, selecione GRCm38 (mm10, Mus musculus). Depois de clicar no sinal verde + , o programa de software detectará automaticamente todas as sequências de motivos adjacentes (PAM) do protoespaçador e, no lado direito da tela, criará uma lista de todos os potenciais gRNAs na área ao redor do éxon de interesse. Percorra a lista até o sinal do códon de parada (*) em uma caixa vermelha, que sinaliza para um gRNA que pode potencialmente transformar um aminoácido em um códon de parada e, assim, resultar em um nocaute. Na primeira coluna à direita da sequência de gRNA, para cada alvo “C” ao redor da janela de edição, as eficiências de edição previstas in silico são calculadas. Certifique-se de que a edição C > T que resulta no códon stop tenha uma eficiência de edição de pelo menos ~10. Clique no valor na coluna Off-Target para verificar a quais loci fora do destino o gRNA poderia se ligar. Evite escolher um gRNA que se liga a quaisquer genes adicionais para aumentar a especificidade. Por exemplo, um bom gRNA para editar Pax6 com um editor de base C > T tem como alvo o éxon 7 e é 5′-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3′. Crie uma anotação no arquivo Benchling clicando no ícone Anotações no canto superior direito da tela, seguido por Nova Anotação. Nomeie a anotação e verifique se a orientação correta do gRNA está selecionada no menu suspenso Strand. Geração de plasmídeos de gRNANOTA: Existem vários vetores disponíveis para entrega de gRNA em organoides. O seguinte plasmídeo foi usado como base para a construção do gRNA: pFYF1320 (Addgene #47511, um presente gentil de Keith Joung).Para clonar os gRNAs em pFYF1320, implemente uma estratégia de PCR inversa utilizando o primer forward padrão: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Para projetar o primer reverso, cole o complemento reverso da sequência espaçadora de gRNA (verifique a orientação do gRNA [+ ou – strand]) na frente da seguinte parte universal do primer reverso: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Para atingir o éxon 7 do mouse Pax6 usando o editor de base C > T, o primer reverso é o seguinte: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Encomende os dois primers. Executar uma reação de PCR inversa usando 1 ng de pFYF1320 como molde usando uma DNA polimerase de alta fidelidade por 35 ciclos a uma temperatura de recozimento de 61 °C. Execute a reação de PCR em um gel de agarose a 1% em tampão TAE a 100 V por ~45 min para visualizar o fragmento esperado de 2.281 pares de bases (pb). Realize uma limpeza em gel usando o kit de sua preferência. Configure a seguinte reação de ligadura: 100 ng de produto de PCR limpo, enzima Dpn1 para remover o DNA do molde pFYF1320 inicial e ligase T4. Incubar a mistura durante 15 min a 20 °C, 30 min a 37 °C e 20 min a 80 °C. Transformar a mistura de reação em bactérias DH5α quimicamente competentes e espalhar as bactérias em placas de ágar contendo ampicilina15. No dia seguinte, colher e expandir três colônias individuais em 3 mL de caldo lisogênico (LB) meio suplementado com 50 μg/mL de ampicilina. No dia seguinte, realizar um miniprep em 1 mL de cada uma das três miniculturas usando um kit miniprep e armazenar o restante a 4 °C. Submeter o plasmídeo obtido ao sequenciamento de Sanger com o primer U6_Forward para garantir que o gRNA seja inserido corretamente no vetor16. Após identificar uma única colônia bacteriana com o plasmídeo correto, inocular 500 μL da minicultura correspondente em 50 mL de LB suplementado com ampicilina para amplificar o DNA plasmidial durante a noite. Realize uma preparação midi no dia seguinte ao uso de um kit midiprep. Este plasmídeo será utilizado para a eletroporação na seção 6. 6. Geração de clones Pax6 KO Eletroporação organoideComece com organoides de camundongo que foram divididos no máximo 5 dias antes para que eles estejam em um estado proliferativo. Use ~300-400 μL de gotículas organoides por knock-out. Incluir uma condição adicional para selecionar um controle negativo que será eletroporado sem qualquer plasmídeo. Execute as etapas 2.1-2.4 para dissociar os organoides, mas dissociar os organoides por mais tempo para que sejam células únicas. Descarte o sobrenadante. Ressuspender as células em 80 μL do tampão de eletroporação. Em um tubo de 1,5 mL, prepare os seguintes plasmídeos para um máximo de 20 μL: 2,5 μg de plasmídeo pFYF1320-gRNA, 2,8 μg de plasmídeo contendo transposase, 7,2 μg de plasmídeo contendo transposon resistente à higromicina e 7,5 μg de pCMV_ABEmax_P2A_GFP.NOTA: O plasmídeo pFYF1320-gRNA codifica o gRNA projetado anteriormente, que orienta o editor de base para o locus alvo. O plasmídeo pCMV_ABEmax_P2A_GFP codifica o editor de base, bem como um repórter GFP, que pode ser usado para monitorar as células que expressam o editor de base após a eletroporação. O plasmídeo contendo transposase codifica a transposase, que cola o de resistência à higromicina fornecido pelo plasmídeo contendo transposon de resistência à higromicina em algum lugar aleatoriamente no genoma. As células que incorporaram este em seu genoma tornam-se resistentes à higromicina e podem ser selecionadas positivamente pela adição de higromicina. Como a co-incorporação de vários plasmídeos é muito provável, a resistência à higromicina constitui uma seleção funcional a ser enriquecida para células que foram editadas para Pax6. Adicione os plasmídeos às células e misture bem, pipetando para cima e para baixo. Montar o eletroporador com os seguintes parâmetros para o pulso de poragem (tensão: 175 V; comprimento de pulso: 5 ms; intervalo de pulso: 50 ms; número de pulsos: 2; taxa de decaimento: 10%; polaridade: +) e para pulso de transferência (tensão: 20 V; comprimento de pulso: 50 ms; intervalo de pulso: 50 ms; número de pulsos: 5; taxa de decaimento: 40%; polaridade: +/-). Coloque as células com os plasmídeos em uma cubeta de eletroporação. Meça imediatamente a resistência (Ω), que deve estar entre 0,30 A e 0,55 A, e eletropore imediatamente. Realizar essa etapa rapidamente é necessário para evitar que as células se instalem no fundo da cubeta e reduzam a eficiência da eletroporação. Transferir as células para um tubo de 1,5 mL e adicionar 400 μL de tampão de eletroporação suplementado com um inibidor de Rho-quinase. Deixe as células se recuperarem em RT por 30 min. Pellet as células a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante e plaquear as células em 200 μL de MEC. Após a solidificação, adicione o meio de expansão do mouse. Os organoides císticos crescem após 2-3 dias. Monitore o sinal GFP, que revela a presença do editor de base C > T, diariamente. Seleção de organoidesApós ~3 dias, quando os organoides tiverem se recuperado, adicione 100 μg/mL de higromicina ao meio de expansão do camundongo para selecionar organoides que integraram o de resistência à higromicina. Há uma alta probabilidade de que as células que absorvem um plasmídeo absorvam vários plasmídeos. Ao selecionar organoides resistentes à higromicina, organoides editados no locus Pax6 são enriquecidos. Quando todas as células no controle negativo estiverem mortas e os organoides sobreviventes forem ~300 μm, escolha os organoides resistentes à higromicina. Colheita e genotipagem de organoidesPreparar pontas P20 estéreis junto ao microscópio e tubos de 1,5 ml contendo 100 μL de solução de tripsina cada sobre gelo. Dobre uma ponta P20 com pinças. Observe a placa contendo os organoides sobreviventes em um microscópio de bancada. Quando um organoide sobrevivente estiver em foco, remova a tampa da placa. Usando a ponta P20 dobrada e ainda sob o microscópio, aspirar cada organoide sobrevivente individualmente e colocar cada um deles em um tubo separado contendo solução de tripsina. Pegue até 20 clones. O número de clones a serem escolhidos depende do número de clones necessários para cada planejamento experimental e da eficiência de edição, que varia de acordo com cada gRNA e locus. Quando todos os clones tiverem sido colhidos, colocar os tubos de 1,5 mL em banho-maria a 37 °C por até 5 min. Vórtice cada tubo regularmente para aumentar a velocidade de dissociação, e verifique os organoides sob o microscópio de bancada. Quando os organoides são dissociados em pequenos aglomerados e/ou células únicas, pare a digestão adicionando 1 mL de meio base. Para cada clone colhido, manter ~400 μL para genótipo em um tubo separado de 1,5 mL. Gire os ~600 μL deixados a 500 x g por 5 min, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 20 μL de MEC, plaqueie-as como uma única gota em um poço de uma placa de 24 poços e adicione meio de expansão de camundongo sem higromicina. Para genotipar os clones, gire os tubos contendo ~400 μL de suspensão celular a 500 x g por 5 min, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 50 μL de tampão de extração de DNA para extrair o DNA. Incubar imediatamente as células da seguinte forma: 6 min a 60 °C, vórtice e 4 min a 95 °C. Esse DNA pode ser mantido por até 7 dias a -20 °C, mas realizar o PCR a jusante imediatamente é o ideal. Para amplificar o locus alvo com a nuclease, realizar uma PCR em 2 μL do DNA extraído usando iniciadores de genotipagem adequados previamente ordenados e uma polimerase de baixa fidelidade. Os primers de genotipagem são AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) e TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). O amplicon deve iniciar cerca de 100 pb a partir do locus editado esperado para garantir que ele seja sequenciado de forma eficiente. Executar o produto de PCR em um gel de agarose para avaliar a eficiência da PCR, conforme mencionado na etapa 5.2.3. Quando uma banda do tamanho correto for detectada, corte-a do gel para realizar uma extração de gel de DNA usando um kit. Sequenciar o DNA extraído de cada clone organoide previamente colhido com os primers de genotipagem. Alinhar as sequências obtidas ao gene Pax6 em Benchling. Abra a sequência genética importada a partir do passo 4.1. Clique em Alinhamentos no lado direito e, em seguida, em Criar novo alinhamento. Carregue os arquivos .ab1 obtidos do provedor de sequenciamento, selecione DNA como um tipo de nucleotídeo e pressione Avançar. Na janela a seguir, selecione Multiseqüência e o programa de alinhamento Automático (MAFFT) antes de clicar em Criar alinhamento. Identificar os genótipos que possuem códon de parada prematura homozigótica (obtido com editores de base) em ambos os alelos. Mantenha os clones organoides correspondentes para expandir e criopreservá-los para análise posterior. Idealmente, três diferentes clones de organoides devem ser analisados lado a lado para contornar potenciais efeitos de nucleases fora do alvo. 7. Transplante ortotópico de organoides da glândula lacrimal humana em camundongos NSG Preparação de organoidesOs organoides da glândula lacrimal humana devem ser divididos ~3 dias antes do dia do transplante, conforme descrito na seção 2. No dia do transplante, certifique-se de que os organoides estejam na fase proliferativa para aumentar as chances de enxerto. Para extrair os organoides da MEC, adicionar dispase ao meio de cultura até atingir uma concentração final de 0,125 U/mL. Usando um P1.000, ressuspenda completamente as gotículas de ECM para interrompê-las e coloque a placa de volta na incubadora de 37 °C por 30 min. Um volume de 100 μL de MEC é suficiente para injetar ~10 glândulas lacrimais. Ressuspender os organoides em 10 mL de meio base para lavar a enzima. Pastilhar as células a 400 x g por 5 min. Ressuspender as células (~1.500.000) em 50 μL de meio de expansão humano frio suplementado com ECM a 5%. Coloque a suspensão organoide no gelo e proceda imediatamente ao transplante. Transplante ortotópico em camundongosNo biotério, coloque a suspensão organoide e agulhas de insulina no gelo. Aspirar a suspensão organoide em uma agulha fria de insulina. Sedar um camundongo imunodeficiente NOD scid gama (NSG) com isoflurano a 3% para iniciar a anestesia. Quando o rato estiver dormindo, coloque-o rapidamente de lado com a glândula lacrimal principal (localizada a meio caminho entre o olho e a orelha) acessível. Injetar 5 μL da suspensão organoide diretamente através da pele na glândula lacrimal. O volume máximo que uma glândula lacrimal de camundongo pode conter é de 5 μL. Permita que o mouse se recupere e monitore o mouse todos os dias para avaliar a presença de qualquer desconforto relacionado ao transplante, especialmente no olho. Avaliar enxertoSacrificar o camundongo com inalação de O 2/CO2 após até 90 dias, dependendo se o enxerto de curto ou longo prazo deve ser avaliado13. Dissecar a glândula lacrimal conforme descrito na secção 1. Fixe em formalina a 4% por 24 h no RT. Coloque a glândula lacrimal em um. Desidratar a glândula lacrimal incubando-a da seguinte forma: 2 h em etanol 70%, 2 h em etanol 96%, 1 h em etanol 100% (2x), 2 h em xileno e pernoite em parafina líquida a 58 °C no forno. No dia seguinte, orientar a glândula lacrimal como preferir em um molde metálico, completar com parafina líquida e deixar o bloco solidificar em uma superfície fria. Este processo é melhor executado com uma máquina de incorporação. Quando o bloco de parafina estiver sólido, corte todo o bloco em seções de 4-5 μm usando um micrótomo. Mantenha todas as seções (em forma de fitas) em um ambiente seco e sem correntes de ar. As seções podem ser mantidas indefinidamente à temperatura ambiente. Amostra de uma em cada 10 seções que abrangem todo o bloco.Monte as seções em uma lâmina da seguinte forma: coloque uma gota de água no escorregador, coloque a seção em cima, deixe descansar por ~2 min para permitir que ela se estique em uma placa quente de 42 °C e remova a água suavemente com papel. Coloque as lâminas para secar durante a noite em forno a 58 °C. Os slides podem ser mantidos indefinidamente no RT após este estágio. Para distinguir células humanas de células de camundongo, realizar coloração de antígeno nuclear humano nessas seções. Reidratar as seções realizando as seguintes lavagens: 3 min em xileno (2x), 1 min em etanol 100% (2x), 1 min cada em etanol 96%, etanol 90%, etanol 80%, etanol 70%, etanol 70%, etanol 60% e etanol 25% e, finalmente, 1 min em água demi (2x). Incubar as lâminas por 15 min em tampão PO (Tabela Suplementar 1). Lave as lâminas 3x em água ultrapura. Realizar uma recuperação de antígeno à base de citrato na autoclave:Coloque as lâminas em um suporte de corrediça à prova de autoclave em uma cesta cheia de tampão citrato (Tabela Suplementar 1). Coloque o cesto na autoclave e execute um ciclo de autoclave (pressão: 10 PSI; temperatura: 121 °C; tempo: 15 min). Quando a autoclave estiver despressurizada, recupere o cesto contendo as lâminas e coloque-o em banho-maria RT para levar as lâminas para RT.NOTA: A estratégia de recuperação de antígeno depende do anticorpo usado. Consulte a ficha técnica do provedor para realizar a recuperação de antígeno mais adequada. Coloque as lâminas horizontalmente, do lado da seção para cima, em uma bandeja de incubação. Adicionar 500 μL de tampão de bloqueio contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por cima e incubar por 1 h. Remova o buffer de bloqueio. Preparar a solução de anticorpos adicionando 1 μL de anticorpo-anticorpo nucleolar humano a 500 μL de tampão de bloqueio por lâmina a ser corada. Adicione a solução de anticorpos a cada lâmina. Incubar durante a noite numa bandeja de incubação humidificada a 4 °C. No dia seguinte, lave as lâminas 3x em PBS. Incubar as lâminas com anticorpo secundário anti-camundongo HRP não diluído por 45 min. Lave as lâminas 3x em PBS.CUIDADO. Em uma capa química, prepare o tampão DAB (Tabela Suplementar 1). Incube as lâminas com buffer DAB por 10 min. Descarte qualquer resíduo em recipientes de resíduos líquidos químicos orgânicos. Lave as lâminas com água. Incubar as lâminas por 2 min em hematoxilina para contracoloração dos núcleos. Lave as lâminas em água corrente da torneira por 10 min. Desidratar as lâminas incubando-as por 1 min cada em etanol 50%, etanol 60%, etanol 70%, etanol 80% e etanol 90%, 1 min em etanol 96% (2x), 1 min em etanol 100% (2x) e 1 min em xileno (2x). Feche as corrediças com meio de montagem e uma lamínula. Após a secagem por cerca de 20 min, observe as lâminas ao microscópio.Eu>