Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Fare deneyleri, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) Hayvan Etik Komitesi tarafından AVD8010020151 proje lisansı altında onaylandı. Organoidler fare fazlası materyalden türetilmiştir. İnsan lakrimal bez biyopsileri, 18-740 protokol numarası altında tıbbi etik kurul tarafından onaylandıktan sonra Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi’nde (UMCU) ameliyat edilen hastaların atık materyallerinden toplandı. Protokol, Şekil 1’de özetlenen birkaç bölüm içerir. Şekil 1: Protokole genel bakış. Bu şekil, protokolün farklı adımlarını vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. NOT: Tüm ortam ve tampon bileşimleri Ek Tablo 1’de açıklanmıştır. 1. Fare ve insan lakrimal bezlerinden organoidlerin kurulması Fare lakrimal bezinin diseke edilmesiMakas, forseps ve diseksiyon pedleri dahil olmak üzere diseksiyon aletlerini hazırlayın. Bir fareyi O2 / CO2 inhalasyon13 ile ötenazi yapın. Ötanazi fareyi diseksiyon pedindeki karnına yerleştirin ve uzuvlarını sabitleyin. Fare kulakları arasında ve alnında bulunan saçları% 70 etanol kullanarak ıslatın. Diseksiyon makası kullanarak, kulaklar arasında kafatasının arkasında bir açıklık açın. Bu açıklığı alnın üzerinden buruna kadar uzatın. Hala makas kullanarak, iki kanat oluşturmak için cildi kulakların arkasından kesin. Şekil 2A’da gösterildiği gibi, lakrimal bezler açığa çıkana kadar flepleri buruna doğru sıkıca çekin. Kanatları diseksiyon pedine sabitleyin. Makas kullanarak, lakrimal bezi tamamen açığa çıkarmak için lakrimal bezin üzerinde bulunan zarda küçük bir kesi yapın. Forsepsleri kullanarak lakrimal bezi çekin. Ana lakrimal kanal yırtılana kadar biraz direnç gösterilmelidir. İsterseniz, ana lakrimal kanalı doğrudan makasla kesin. Fare lakrimal bezini daha sonraki işlemlere kadar doku kültürü sınıfı PBS’ye yerleştirin. Hücre ölümünü sınırlamak için lakrimal bezi 2-4 saat içinde işlemeye devam edin. Bu daha uzun sürerse, fare lakrimal bezini biyopsi toplama ortamına yerleştirin (Ek Tablo 1).NOT: Çok sayıda organoide hemen ihtiyaç duyulursa birkaç lakrimal bez havuzlanabilir. İnsan lakrimal bezi biyopsilerinin toplanmasıAmeliyattan önce, 50 mL’lik bir tüpte 20 mL alikot biyopsi toplama ortamı (Ek Tablo 1) hazırlayın ve bunu ameliyattan önce cerraha verin. Bu ortam birkaç ay boyunca 4 ° C’de tutulabilir. Ameliyat gününde, cerrahın lakrimal bezin bir parçasını (genellikle <1 mm3) örneklemesine ve 4 ° C’de biyopsi toplama ortamında (Ek Tablo 1) saklamasına izin verin. En kısa sürede işlemek için biyopsiyi toplayın. İdeal olarak, bu biyopsi örneklemesinden sonraki 2 saat içinde aynı gün olmalıdır. Organoid türetmeAşağıdakileri önceden hazırlayın: çözülmüş hücre dışı matris (ECM), oda sıcaklığı (RT) fare veya insan genleşme ortamı (Ek Tablo 1), çözülmüş kollajenaz, taban ortamı (Ek Tablo 1), iki neşter, bir adet 10 cm’lik Petri kabı, 15 mL’lik bir tüpe takılı 70 μm’lik bir süzgeç ve 30 dakika boyunca 37 ° C’de önceden ısıtılmış 12 kuyucuklu süspansiyon plakaları. Ek Tablo 1’de gösterilen tüm bileşenleri birleştirerek sindirim ortamını hazırlayın. Doku parçalarının yapışmasını önlemek için neşterleri bu ortamda önceden ıslatın. Fare veya insan lakrimal bez dokusunu ortamdan alın ve Petri kabına yerleştirin. Önceden ıslatılmış neşterleri kullanarak dokuyu kıyın. Doku parçaları çok küçük olduğunda (yani, <0,5 mm3), neşterle Petri kabından kazıyarak sindirim ortamına yerleştirin. İnsan biyopsisi zaten çok küçükse, doku kaybını önlemek için kıyma yapmadan doğrudan sindirim ortamına yerleştirin. Doku parçalarını 37 ° C’lik bir su banyosunda 15 dakikaya kadar inkübe edin. Parçaları yeniden askıya almak için 15 mL’lik tüpü düzenli olarak ters çevirin. Dokuyu aşırı sindirmemek için hücre ayrışmasını tezgah üstü mikroskop altında izleyin. Bu arada, bir Pasteur pipetini, dönerken ucunu bir aleve yerleştirerek daraltın ve taban ortamında önceden ıslatın. Dokuyu verimli bir şekilde ayrıştırmak için, deliğin kalan en büyük doku parçalarından biraz daha küçük olduğundan emin olun. Ayrışma işlemini kolaylaştırmak için, karışımı her 5 dakikada bir, önceden ıslatılmış daraltılmış Pasteur pipet ile yukarı ve aşağı doğru pipetin. Mikroskop altında birçok tek hücre ve küçük kümeler göründüğünde, baz ortamın 10 mL’sini ekleyerek ayrışmayı durdurun. Hücreleri pelet etmek için 5 dakika boyunca 400 x g’de döndürün. Süpernatanı çıkarın ve yıkamayı tekrarlamak için pelet baz ortamın 10 mL’sinde tekrar askıya alın. ECM’nin yeterli polimerizasyonunu önleyecek büyük sindirilmemiş doku parçalarını ve kalan kollajen liflerini çıkarmak için 70 μm’lik bir süzgeçten geçirin. Elüatı 5 dakika boyunca 400 x g’de döndürün.NOT: Kırmızı hücre peleti, normalde organoid türetmeyi engellemeyen kırmızı kan hücrelerinin varlığını gösterir. Bununla birlikte, akış sitometrisi gibi bazı uygulamalar için, kırmızı kan hücreleri lize edilmelidir. Bunun için, hücreleri 5 dakika boyunca RT’de 5 mL taze kırmızı kan hücresi lizis tamponunda inkübe edin ve hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g’de pelet edin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini tek bir fare lakrimal bezi için 100 μL soğuk ECM’de ve insan biyopsisi için 50 μL soğuk ECM’de yeniden askıya alın. Yeniden askıya alırken, kabarcıklar yapmamaya dikkat edin, çünkü bunlar ECM polimerizasyonunu ve stabilitesini de etkiler. 12 delikli bir süspansiyon plakasının kuyucuğu başına 100 μL’ye kadar hücre tohumu. Kuyuda ~ 20 μL damlacıklar yapmak için bir P200 kullanın. Damlacıklar ne kadar küçük olursa, büyüme faktörlerinin ve besin maddelerinin matris boyunca difüzyonu o kadar iyi olur. ECM’nin katılaşmasını sağlamak için plakayı 20-30 dakika boyunca 37 ° C’de nemlendirilmiş bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin. ECM katılaştıktan sonra, 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu başına ~1 mL RT fare veya insan genleşme ortamı ekleyin. Organoidler 300 μm’lik bir boyuta ulaşana kadar ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Bunun için, ortamı kuyuya aspire edin ve ECM damlacıklarına dokunmadan kuyunun yan tarafına yavaşça genleşme ortamı ekleyin, böylece onları bozmayın.NOT: Primosin (100 mg/mL; ticari stoktan 1:1.000), bakteriyel kontaminasyon meydana gelirse izolasyon üzerine eklenebilir. Bununla birlikte, organoid büyümesini de yavaşlattığı için, bir veya iki pasajdan sonra eklenmemesi veya çıkarılması tercih edilir. 2. Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerinin genişletilmesi Fare organoidleri için ~ 7 gün ve insan organoidleri için ~ 10 gün sonra, organoidler ~ 300 μm’lik bir boyuta ulaştığında, kültür ortamını çıkarın. Organoidleri içeren ECM damlacıklarını 1 mL tripsin çözeltisinde, damlacıklar parçalanana kadar bir P1.000 ile kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar askıya alın. Bu karışımı 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve 37 ° C’lik bir su banyosunda kısa bir süre inkübe edin. 2-3 dakika sonra, organoid süspansiyonu 10x-15x yukarı ve aşağı borulamak için daraltılmış ve önceden ıslatılmış bir Pasteur pipet kullanın. Organoidlerin ayrışma durumunu bir tezgah üstü mikroskop altında kontrol edin; ~ 20 hücreden oluşan küçük kümeler elde edilmelidir. 37 °C su banyosunda daha uzun süre inkübe edin ve ayrışma tatmin edici olana kadar pipetleme adımını tekrarlayın.NOT: Bu adım, çok katmanlı oldukları için insan organoidleri için daha uzun sürebilir. Tek hücreler üretilecek; Bu, organoid süspansiyonun çoğu küçük kümelerden oluştuğu sürece organoid büyümesini etkilemez. Baz ortamın 10 mL’sini ekleyerek ayrışmayı durdurun. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g’de pelet haline getirin. Organoidlerin üzerine uzanabilecek süpernatant ve ECM’yi (organoidler olmadan şeffaf, jöle benzeri tabaka) çıkardıktan sonra, adım 1.3.10’da belirtildiği gibi bir süspansiyon plakasına kaplamadan önce hücreleri uygun bir soğuk ECM hacminde yeniden askıya alın.NOT: Genel olarak, fare lakrimal organoidleri 1: 5 oranında ve insan organoidleri 1: 3 oranında bölünür. Bu, 100 μL ECM’de bulunan organoidlerle başlarken, bölünmeden sonra sırasıyla 500 μL ve 300 μL’de yeniden askıya alınmaları gerektiği anlamına gelir. ECM’nin katılaşmasına kadar plakayı 37 ° C’lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca baş aşağı inkübe edin ve organoidleri RT’de fare veya insan genleşme ortamı ile örtün. 3. Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerini koruyan kriyopreservasyon Organoidleri kriyoproteksiyona tabi tutmak için, önce genleşme ortamındaki organoidleri bölüm 2’de verilen talimatlara göre bölün. Yaklaşık 3-4 gün sonra, organoidler büyüme aşamasındayken, ortamı çıkarın ve 10 mL soğuk baz ortamında organoidler içeren ECM’nin 100 μL’sini yeniden askıya alın. ECM’nin ayrışmasına yardımcı olmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu işlemi kolaylaştırmak için tüpü düzenli olarak çevirin. Organoidleri 5 dakika boyunca 500 x g’de peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve organoid peleti 1 mL kriyoprezervasyon ortamında yeniden askıya alın (artık ECM kriyoprezervasyonu bozmaz). Organoid süspansiyonu bir kriyoviyal ve hemen -80 ° C’lik bir dondurucuya aktarın.NOT: Malzeme Tablosunda açıklanan kriyoprezervasyon ortamını kullanırken, kriyovyaller süresiz olarak -80 ° C’lik bir dondurucuda tutulabilir. Başka bir kriyoprezervasyon ortamı kullanılıyorsa, optimum korumayı sağlamak için kriyoviyal 24 saat sonra bir sıvı azot tankına aktarın. Organoidleri çözmek için, kriyoviyal dondurucudan alın ve kuru buz üzerinde 37 ° C’lik bir su banyosuna taşıyın. İçeriğinin çoğu çözülene kadar kriyoviyal suda tutun. İçeriği 10 mL baz ortamı içeren 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g’de döndürün. Organoidleri, adım 2.5 ve adım 2.6’da açıklandığı gibi, genleşme ortamı ile 100 μL ECM’de kaplayın. 4. Lakrimal bez organoidlerinin ayırt edilmesi ve işlevselliğinin değerlendirilmesi Organoid farklılaşmaLakrimal bez organoidlerini ayırt etmek için, önce genleşme ortamındaki organoidleri bölüm 2’deki talimatlara göre bölün. 2 gün sonra, genişletme ortamını adım 1.3.12’de açıklandığı gibi fare veya insan farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Fare organoidlerini bu ortamda 5 gün ve insan organoidlerini 9 gün boyunca korumak için ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Diferansiyasyon ortamında 5 gün veya 9 gün sonra organoid farklılaşmasını değerlendirmek için, RNA’yı çıkarmak için organoidler içeren 100 μL ECM toplayın. Bunu yapmak için, ECM damlacıklarını bir P1.000 kullanarak kuyuda bulunan 1 mL ortamdaki yeniden askıya alın ve organoid süspansiyonu 3 mL buz gibi soğuk baz ortamına aktarın. Organoidleri 5 dakika boyunca 500 x g’de peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti RNA ekstraksiyon tamponunda yeniden askıya alın. Aşağı akış RNA ekstraksiyonunu, RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarına göre gerçekleştirin. Örneğin, elde edilen RNA’yı, kök hücrelerin (TP63, KRT5, KRT14) ve farklılaşmış hücre belirteçlerinin (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2…) ekspresyonunun RT-qPCR analizi için kullanın. 14.NOT: İlgili ekspresyon analizini elde etmek için, seçilen belirteçlerin ekspresyonunu bir veya birkaç doku örneğinde ölçün. Farklılaşma koşulları altında kültürlenen organoidler daha az RNA içerme eğilimindedir. Fonksiyonel şişlik testiNOT: Protokolün bu kısmı için, en az 7 gün boyunca farklılaşmış insan lakrimal bezi organoidlerini kullanın. Fonksiyonel yırtılma için yeterli belirteç ekspresyonunu sağlamak için gereken minimum süre 7 gündür. 12 delikli bir plakanın her bir kuyusu bir koşul oluşturur. Minimum koşul sayısı üçtür: pozitif kontrol, negatif kontrol ve test koşulu.Taze olarak, lakrimal bez organoidleri tarafından salgılanmayı indükleyen bireysel bileşenler içeren 1 mL insan farklılaşma ortamı hazırlayın. Örneğin, 100 μM noradrenalin ve 1 μM forskolin ekleyin ve iyice karıştırın.NOT: Forskolin, genellikle maksimum şişmeye neden olan pozitif bir kontrol görevi görür. Otomatik bir parlak alan hızlandırılmış mikroskopta, plakada görüntülenecek konumları, zaman aralığını (5 dakika) ve süreyi (4 saat) ayarlayın. ECM damlacığının tamamının her konumda görünür olduğundan emin olun. Görüntülemeye başlamadan hemen önce ve plakayı mikroskoptan hareket ettirmeden, kültür ortamını görüntülenecek kuyucuklardan çıkarın ve adım 4.2.1’de hazırlanan iyi askıya alınmış ortamla değiştirin. Negatif bir kontrol olarak, yalnızca farklılaşma ortamı ile değiştirilen farklılaşma ortamına sahip bir kuyuyu dahil edin, çünkü orta tazeleme bazı organoid şişmeyi tetikleyebilir. 4 saate kadar sonra, şişme testi biter. Sonuçları analiz edin.NOT: Bu adımlar, otomatik parlak alan hızlandırılmış görüntülemeye izin veren bir EVOS M7000 mikroskobu ile gerçekleştirilir. Bu mikroskop için, hızlandırılmış görüntülemeyi ayarlamak üzere ayrıntılı üreticinin el kitabına bakın. Not olarak, benzer özelliklere sahip başka herhangi bir mikroskop kullanılabilir. Organoid şişmesini ölçmek için, her bir organoidin çapını 0 saat ve 4 saatte ölçün. Tek bir organoid damlacığın görüntülerini ImageJ’de 0 saat ve 4 saatte açın. Araç çubuğundaki Düz çizgi simgesine tıklayın ve önce bir organoidin çapını 0 saatte çizin. Ardından, bu çizginin uzunluğunu ve dolayısıyla şişmeden önceki organoid çapı ölçmek için ImageJ’deki (Analiz > Ölç) Ölçüm aracını kullanın. Şişlikten sonra organoid çapını elde etmek için işlemi aynı organoid üzerinde 4 saatte tekrarlayın. Şişme tahlilinden önce ve sonra durum başına ~ 20 organoidin organoid çapını ölçün. 5. Pax6’yı nakavt etmek için bir plazmid inşa etmek nakavt etmek için gRNA tasarımı Pax6 C > T tabanlı editörleri kullanmaNOT: gRNA tasarımı için birçok yazılım programı mevcuttur. Burada, entegre gRNA tasarımına, ek açıklamaya ve Sanger izlerinin hizalanmasına izin verdiği için Benchling kullanılmıştır. Bu nedenle, sonraki tüm adımlar alternatif yazılım programları kullanılarak da gerçekleştirilebilir.Yeni (+) > DNA Dizisi > DNA Dizilerini İçe Aktar’a tıklayarak hedef geni Benchling’de görselleştirerek gRNA tasarım sürecine başlayın. Veritabanından İçe Aktar sekmesinde, ilgilendiğiniz geni (Pax6) yazın ve Ara’ya basın. Fare referans genomu GRCm38’in (mm10, Mus musculus) en yeni yapısını seçin ve İçe Aktar’a basın. Aşağıdaki kurallara bağlı kalarak nakavt gRNA’nın tasarlanabileceği ekzonu seçin:İlk kodlama ekzonuna bir gRNA koymaktan kaçının, çünkü sonraki ekzonlardaki alternatif başlangıç bölgeleri, hücre tarafından erken indüklenen durdurma kodonunu atlatmak için kullanılabilir. Pax6 mRNA’nın eklenmesiyle oluşabilecek tüm alternatif transkriptlerde bulunan ekzonlardaki gRNA’ları tasarlayın. Bunu sağlamak için, Ensembl genom tarayıcısında Pax6’yı görselleştirin ve tüm transkriptlerde kullanılan ekzonu seçin. Alternatif eklemeyi daha da atlatmak için, tamamlanmamış bir kodona sahip bir ekzonu hedefleyin (üçlünün kalan bir veya iki tabanı). Bu daha az önemlidir, ancak indüklenmiş indellerin etkileri hakkında daha fazla kesinlik sağlar. Pax6 için, ekzon 4 ila ekzon 11 iyi bir hedeftir. Ek olarak, triptofan (W), glutamin (Q) veya arginin (R) kalıntıları içeren bir ekzon seçin.NOT: SpCas9 kullanan standart C > T baz editörleri, gRNA’nın başlangıcından itibaren nükleotid 4’ten nükleotid 8’e kadar uzanan bir düzenleme penceresine sahiptir (PAM’dan en uzakta). C > T baz editörleri, ters iplikçikte bir gRNA bulunan tüm triptofan (W) kalıntılarına (TGG’den TGA’ya, TAG veya TAA’ya), glutamin (Q) kalıntılarına (CAG’den TAG’a veya CAA’dan TAA’ya) ve son olarak, ileri iplikçikteki arginin (R) kalıntılarına (CGA’dan TGA’ya) durdurma kodonları uygulayabilir. Ekzon + 20 taban yukarı ve aşağı akış seçin. Hedef işareti CRISPR’de ekranın sağ tarafına tıklayın ve Tasarım ve Analiz kılavuzlarına tıklayın. Yeni açılan menüde, Tasarım Türü sekmesi altında, ” temel düzenleme” için Kılavuzları işaretleyin (Komor ve ark., 2016). Kılavuz Uzunluğu’nu 20 nükleotidde tutun ve Fare için Genom altında GRCm38 (mm10, Mus musculus) öğesini seçin. Yeşil + işaretine tıkladıktan sonra, yazılım programı tüm protospacer bitişik motif (PAM) dizilerini otomatik olarak algılar ve ekranın sağ tarafında, ilgilenilen ekzonun etrafındaki alandaki tüm potansiyel gRNA’ların bir listesini oluşturur. Kırmızı bir kutudaki durdurma kodonu işaretine (*) kadar listede ilerleyin; bu, potansiyel olarak bir amino asidi bir durdurma kodonuna dönüştürebilecek ve böylece bir nakavtla sonuçlanabilecek bir gRNA’ya işaret eder. gRNA dizisinin sağındaki ilk sütunda, düzenleme penceresinin etrafındaki her hedef “C” için, in silico öngörülen düzenleme verimlilikleri hesaplanır. Durdurma kodonu ile sonuçlanan C > T düzenlemesinin en az ~ 10 düzenleme verimliliğine sahip olduğundan emin olun. gRNA’nın hangi hedef dışı lokuslara bağlanabileceğini kontrol etmek için Hedef Dışı sütunundaki değere tıklayın. Özgüllüğü artırmak için herhangi bir ek gene bağlanan bir gRNA seçmekten kaçının. Örneğin, Pax6’yı bir C > T baz editörü ile düzenlemek için iyi bir gRNA, ekzon 7’yi hedefler ve 5′-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3′ dür. Ekranın sağ üst köşesindeki Ek Açıklamalar simgesine ve ardından Yeni Ek Açıklama’ya tıklayarak Benchling dosyasında bir ek açıklama oluşturun. Ek açıklamayı adlandırın ve Strand açılır menüsünde doğru gRNA yönünün seçildiğinden emin olun. gRNA plazmid üretimiNOT: Organoidlere gRNA iletimi için çeşitli vektörler mevcuttur. Aşağıdaki plazmid, gRNA yapımı için bir baz olarak kullanılmıştır: pFYF1320 (Addgene #47511, Keith Joung’dan bir tür hediye).pFYF1320’deki gRNA’ları klonlamak için, standart ileri astarı kullanarak ters bir PCR stratejisi uygulayın: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Ters astarı tasarlamak için, gRNA ara parça dizisinin ters tamamlayıcısını aşağıdaki evrensel ters astar parçasının önüne yapıştırın (gRNA oryantasyonunu [+ veya – ipliği] iki kez kontrol edin): CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. C > T taban düzenleyicisini kullanarak fare Pax6’nın ekzon 7’sini hedeflemek için ters astar aşağıdaki gibidir: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Her iki astarı da sipariş edin. 61 °C’lik bir tavlama sıcaklığında 35 döngü boyunca yüksek doğrulukta bir DNA polimeraz kullanarak şablon olarak 1 ng pFYF1320 kullanarak ters bir PCR reaksiyonu çalıştırın. PCR reaksiyonunu, 2.281 baz çiftinin (bp) beklenen parçasını görselleştirmek için TAE tamponunda 100 V’ta ~ 45 dakika boyunca% 1’lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Tercih ettiğiniz kiti kullanarak jel temizliği yapın. Aşağıdaki ligasyon reaksiyonunu ayarlayın: 100 ng temizlenmiş PCR ürünü, ilk pFYF1320 şablon DNA’sını çıkarmak için Dpn1 enzimi ve T4 ligaz. Karışımı 20 °C’de 15 dakika, 37 °C’de 30 dakika ve 80 °C’de 20 dakika inkübe edin. Reaksiyon karışımını kimyasal olarak yetkin DH5α bakterilerine dönüştürün ve bakterileri ampisilin15 içeren agar plakalarına yayın. Ertesi gün, 50 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 3 mL lizojen suyu (LB) ortamında üç ayrı koloni seçin ve genişletin. Ertesi gün, bir miniprep kiti kullanarak üç mini kültürün her birinin 1 mL’sinde bir mini hazırlık gerçekleştirin ve geri kalanını 4 ° C’de saklayın. Elde edilen plazmidi, gRNA’nın vektör16’ya doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için U6_Forward astarı ile Sanger dizilemesine tabi tutun. Doğru plazmid ile tek bir bakteri kolonisini tanımladıktan sonra, plazmid DNA’sını bir gecede yükseltmek için ampisilin ile desteklenmiş 50 mL LB içinde karşılık gelen mini kültürün 500 μL’sini aşılayın. Bir midiprep kiti kullandıktan sonraki gün bir midi hazırlığı gerçekleştirin. Bu plazmid, bölüm 6’daki elektroporasyon için kullanılacaktır. 6. Pax6 KO klonlarının oluşturulması Organoid elektroporasyonEn fazla 5 gün önce bölünmüş fare organoidleri ile başlayın, böylece proliferatif bir durumda olurlar. Nakavt başına ~ 300-400 μL organoid damlacık kullanın. Herhangi bir plazmid olmadan elektroporate edilecek negatif bir kontrol seçmek için ek bir koşul ekleyin. Organoidleri ayırmak için 2.1-2.4 arasındaki adımları uygulayın, ancak organoidleri tek hücre olacak şekilde daha uzun süre ayırın. Supernatan’ı atın. Hücreleri elektroporasyon tamponunun 80 μL’sinde yeniden askıya alın. 1.5 mL’lik bir tüpte, aşağıdaki plazmidleri maksimum 20 μL için hazırlayın: 2.5 μg pFYF1320-gRNA plazmidi, 2.8 μg transpozaz içeren plazmid, 7.2 μg higromisin direnci transpozon içeren plazmid ve 7.5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.NOT: pFYF1320-gRNA plazmid, baz editörü hedef lokusa yönlendiren önceden tasarlanmış gRNA’yı kodlar. pCMV_ABEmax_P2A_GFP plazmid, baz editörünü ve elektroporasyonu takiben baz editörü ifade eden hücreleri izlemek için kullanılabilecek bir GFP muhabirini kodlar. Transpozaz içeren plazmid, higromisin direnci transpozon içeren plazmid tarafından sağlanan higromisin direnç kasetini genomun içine rastgele bir yere yapıştıran transpozazı kodlar. Bu kaseti genomlarına dahil eden hücreler higromisin’e dirençli hale gelir ve higromisin ilavesiyle pozitif olarak seçilebilir. Birkaç plazmidin birlikte birleştirilmesi çok muhtemel olduğundan, higromisin direnci, Pax6 için düzenlenmiş hücreler için zenginleştirmek için fonksiyonel bir seçim oluşturur. Plazmidleri hücrelere ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Elektroportatörü gözenekli darbe (voltaj: 175 V; darbe uzunluğu: 5 ms; darbe aralığı: 50 ms; darbe sayısı: 2; bozunma oranı: ; polarite: +) ve transfer darbesi (voltaj: 20 V; darbe uzunluğu: 50 ms; darbe aralığı: 50 ms; darbe sayısı: 5; bozunma oranı: ; polarite: +/-) için aşağıdaki parametrelerle ayarlayın. Hücreleri plazmidlerle birlikte bir elektroporasyon küvetine yerleştirin. Hemen 0.30 A ile 0.55 A arasında olması gereken direnci (Ω) ölçün ve hemen elektroporat yapın. Bu adımın hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi, hücrelerin küvetin dibine yerleşmesini önlemek ve elektroporasyon verimliliğini azaltmak için gereklidir. Hücreleri 1.5 mL’lik bir tüpe aktarın ve bir Rho-kinaz inhibitörü ile desteklenmiş 400 μL elektroporasyon tamponu ekleyin. Hücrelerin RT’de 30 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g’de pelet yapın, süpernatanı atın ve hücreleri 200 μL ECM’de plakalayın. Katılaştıktan sonra, fare genişletme ortamını ekleyin. Kistik organoidler 2-3 gün sonra büyür. C > T baz editörünün varlığını ortaya çıkaran GFP sinyalini günlük olarak izleyin. Organoid seçimi~ 3 gün sonra, organoidler iyileştiğinde, higromisin direnç kasetini entegre eden organoidleri seçmek için fare genleşme ortamına 100 μg / mL higromisin ekleyin. Bir plazmid alan hücrelerin birkaç plazmid alma olasılığı yüksektir. Higromisine dirençli organoidler seçilerek, Pax6 lokusundaki düzenlenmiş organoidler zenginleştirilir. Negatif kontroldeki tüm hücreler öldüğünde ve hayatta kalan organoidler ~ 300 μm olduğunda, higromisin dirençli organoidleri seçin. Organoid toplama ve genotiplemeMikroskobun yanında steril P20 uçları ve buz üzerinde her biri 100 μL tripsin çözeltisi içeren 1.5 mL tüpler hazırlayın. Bir P20 ucunu forseps ile bükün. Hayatta kalan organoidleri içeren plakayı tezgah üstü mikroskopta gözlemleyin. Hayatta kalan bir organoid odaktayken, plakanın kapağını çıkarın. Bükülmüş P20 ucunu kullanarak ve hala mikroskop altında, hayatta kalan her organoidi ayrı ayrı aspire edin ve bunların her birini tripsin çözeltisi içeren ayrı bir tüpe yerleştirin. En fazla 20 klon alın. Seçilecek klonların sayısı, her deneysel tasarım için gereken klon sayısına ve her gRNA ve lokusa bağlı olarak değişen düzenleme verimliliğine bağlıdır. Tüm klonlar toplandığında, 1,5 mL’lik tüpleri 5 dakikaya kadar 37 ° C’lik bir su banyosuna yerleştirin. Ayrışma hızını artırmak için her tüpü düzenli olarak vorteks edin ve organoidleri tezgah üstü mikroskop altında kontrol edin. Organoidler küçük kümelere ve / veya tek hücrelere ayrıldığında, 1 mL baz ortamı ekleyerek sindirimi durdurun. Seçilen her klon için, ayrı bir 1.5 mL tüpte ~ 400 μL genotipe tutun. 5 dakika boyunca 500 x g’de kalan ~ 600 μL’yi döndürün, süpernatanı çıkarın, hücreleri 20 μL ECM’de yeniden askıya alın, 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda tek bir damlacık olarak plakalayın ve higromisin olmadan fare genleşme ortamı ekleyin. Klonları genotiplendirmek için, 5 dakika boyunca 500 x g’de ~ 400 μL hücre süspansiyonu içeren tüpleri döndürün, süpernatanı çıkarın ve DNA’yı çıkarmak için hücreleri 50 μL DNA ekstraksiyon tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri hemen aşağıdaki gibi inkübe edin: 60 ° C’de 6 dakika, vorteks ve 95 ° C’de 4 dakika. Bu DNA, -20 ° C’de 7 güne kadar saklanabilir, ancak aşağı akış PCR’sini hemen gerçekleştirmek en uygunudur. Nükleaz ile hedeflenen lokusu yükseltmek için, önceden sipariş edilen yeterli genotipleme primerleri ve düşük doğruluklu bir polimeraz kullanarak ekstrakte edilen DNA’nın 2 μL’sinde bir PCR gerçekleştirin. Genotipleme primerleri AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) ve TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R) ‘dir. Amplikon, verimli bir şekilde sıralandığından emin olmak için beklenen düzenlenmiş lokustan yaklaşık 100 bp başlamalıdır. Adım 5.2.3’te belirtildiği gibi PCR verimliliğini değerlendirmek için PCR ürününü bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Doğru boyutta bir bant tespit edildiğinde, bir kit kullanarak DNA jeli ekstraksiyonu yapmak için jelden kesin. Daha önce genotipleme primerleri ile seçilen her organoid klondan ekstrakte edilen DNA’yı dizileyin. Elde edilen dizileri Benchling’deki Pax6 geniyle hizalayın. İçe aktarılan gen dizisini adım 4.1’den açın. Sağ taraftaki Hizalamalar’a ve ardından Yeni hizalama oluştur’a tıklayın. Dizileme sağlayıcısından alınan .ab1 dosyalarını yükleyin, nükleotid türü olarak DNA’yı seçin ve İleri’ye basın. Aşağıdaki pencerede, Hizalama oluştur’a tıklamadan önce Çok Sıralı ve hizalama programı Otomatik (MAFFT) öğesini seçin. Her iki alel üzerinde homozigot prematüre durdurma kodonuna (baz editörlerle elde edildiği gibi) sahip genotipleri tanımlayın. Genişlemek için ilgili organoid klonları saklayın ve daha fazla analiz için bunları kriyoprotekte edin. İdeal olarak, potansiyel nükleaz hedef dışı etkilerini atlatmak için üç farklı organoid klonu yan yana analiz edilmelidir. 7. NSG farelerinde insan lakrimal bezi organoidlerinin ortotopik transplantasyonu Organoid preparatıİnsan lakrimal bezi organoidleri, bölüm 2’de açıklandığı gibi, transplantasyon gününden ~ 3 gün önce bölünmelidir. Transplantasyon gününde, engraftman şansını artırmak için organoidlerin proliferatif fazda olduğundan emin olun. Organoidleri ECM’den çıkarmak için, 0.125 U / mL’lik nihai konsantrasyona ulaşmak için kültür ortamına dispaz ekleyin. Bir P1.000 kullanarak, ECM damlacıklarını bozmak için iyice askıya alın ve plakayı 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre geri yerleştirin. 100 μL’lik bir ECM hacmi, ~ 10 lakrimal bezi enjekte etmek için yeterlidir. Enzimi yıkamak için organoidleri 10 mL baz ortamda tekrar askıya alın. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g’de pelet yapın. Hücreleri (~ 1.500.000) % 5 ECM ile desteklenmiş 50 μL soğuk insan genleşme ortamında yeniden askıya alın. Organoid süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin. Farelerde ortotopik transplantasyonHayvan tesisinde, organoid süspansiyonu ve insülin iğnelerini buz üzerinde bulundurun. Organoid süspansiyonu soğuk bir insülin iğnesinde aspire edin. Anesteziyi başlatmak için NOD scid gama (NSG) immün yetmezlikli bir fareyi %3 izofluran ile yatıştırın. Fare uyurken, ana lakrimal bezin (göz ile kulak arasında yarı yolda bulunan) erişilebilir olduğu şekilde hızlı bir şekilde yan tarafına yerleştirin. 5 μL organoid süspansiyonu doğrudan deriden lakrimal beze enjekte edin. Bir fare lakrimal bezinin içerebileceği maksimum hacim 5 μL’dir. Farenin iyileşmesine izin verin ve özellikle göz üzerinde transplantasyonla ilgili herhangi bir rahatsızlığın varlığını değerlendirmek için fareyi her gün izleyin. Engraftmanı değerlendirinKısa süreli veya uzun süreli engraftasyonun değerlendirilmesi gerekip gerekmediğine bağlı olarak 90 güne kadar O2/CO2 inhalasyonu ile fareyi kurban edin13. Lakrimal bezi bölüm 1’de tarif edildiği gibi diseke edin. RT’de 24 saat boyunca% 4 formalin içinde sabitleyin. Lakrimal bezi bir kasete yerleştirin. Lakrimal bezi aşağıdaki gibi inkübe ederek dehidrate edin:% 70 etanolde 2 saat,% 96 etanolde 2 saat,% 100 etanolde (2x) 1 saat, ksilende 2 saat ve fırında 58 ° C’de sıvı parafinde bir gece. Ertesi gün, lakrimal bezi metalik bir kalıpta tercih edildiği gibi yönlendirin, sıvı parafin ile doldurun ve bloğun soğuk bir yüzeyde katılaşmasına izin verin. Bu işlem en iyi şekilde bir gömme makinesi ile gerçekleştirilir. Parafin bloğu katı olduğunda, bir mikrotom kullanarak tüm bloğu 4-5 μm kesitlere ayırın. Tüm bölümleri (kurdele şeklinde) kuru ve cereyan etmeyen bir ortamda tutun. Bölümler oda sıcaklığında süresiz olarak tutulabilir. Tüm bloğu kapsayan her 10 bölümden birini örnekleyin.Bölümleri bir slayta aşağıdaki gibi monte edin: slaytın üzerine bir damla su koyun, bölümü üstüne yerleştirin, 42 ° C’lik bir sıcak plaka üzerinde gerilmesini sağlamak için ~ 2 dakika dinlendirin ve suyu yavaşça kağıtla çıkarın. Kızakları gece boyunca 58 °C’lik bir fırında kurumaya bırakın. Slaytlar bu aşamadan sonra RT’de süresiz olarak tutulabilir. İnsan hücrelerini fare hücrelerinden ayırt etmek için, bu bölümler üzerinde insan nükleer antijen boyaması yapın. Aşağıdaki yıkamaları yaparak bölümleri yeniden sulandırın: Ksilen (2x) içinde 3 dakika,% 100 etanol (2x) içinde 1 dakika,% 96 etanol,% 90 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol,% 60 etanol ve% 25 etanol içinde 1 dakika ve son olarak, demi suda (2x) 1 dakika. Slaytları PO tamponunda 15 dakika boyunca inkübe edin (Ek Tablo 1). Slaytları ultra saf suda 3 kat yıkayın. Otoklavda sitrat bazlı bir antijen alımı gerçekleştirin:Slaytları otoklav geçirmez bir slayt tutucuya, sitrat tamponu ile doldurulmuş bir sepete yerleştirin (Ek Tablo 1). Sepeti otoklavın içine yerleştirin ve bir otoklav döngüsü çalıştırın (basınç: 10 PSI; sıcaklık: 121 °C; süre: 15 dakika). Otoklav basınçsızlaştırıldığında, slaytları içeren sepeti alın ve slaytları RT’ye getirmek için bir RT su banyosuna yerleştirin.NOT: Antijen alma stratejisi kullanılan antikora bağlıdır. En uygun antijen alımını gerçekleştirmek için sağlayıcının veri sayfasına bakın. Slaytları yatay olarak, bölüm tarafı yukarı, bir inkübasyon tepsisine yerleştirin. Üstüne PBS’de %1 sığır serum albümini (BSA) içeren 500 μL bloke edici tampon ekleyin ve 1 saat boyunca inkübe edin. Engelleme arabelleğini çıkarın. Boyanacak slayt başına 500 μL bloke edici tampona 1 μL insan nükleolar antijen-antikoru ekleyerek antikor çözeltisini hazırlayın. Her slayda antikor çözeltisi ekleyin. 4 ° C’de nemlendirilmiş bir inkübasyon tepsisinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, slaytları PBS’de 3 kez yıkayın. Slaytları seyreltilmemiş HRP anti-fare sekonder antikoru ile 45 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları PBS’de 3 kez yıkayın.DİKKAT. Kimyasal bir başlıkta, DAB tamponunu hazırlayın (Ek Tablo 1). Slaytları DAB tamponu ile 10 dakika boyunca inkübe edin. Herhangi bir atık malzemeyi organik kimyasal sıvı atık konteynerlerine atın. Slaytları suyla yıkayın. Çekirdekleri boyamak için slaytları hematoksilin içinde 2 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları akan musluk suyunda 10 dakika yıkayın. Slaytları etanol, etanol, etanol, etanol ve etanolde 1 dakika, etanolde (2x) 1 dakika, 0 etanolde (2x) 1 dakika ve ksilende (2x) 1 dakika inkübe ederek kurutun. Kızakları montaj ortamı ve bir kapak kayması ile kapatın. Yaklaşık 20 dakika kuruduktan sonra, slaytları mikroskop altında gözlemleyin.i>