このプロトコルは、初代マウスおよびヒト組織に由来する涙腺オルガノイドを確立、維持、遺伝子改変、分化、機能的に特徴付け、および移植する方法を説明しています。
涙腺は、眼表面の恒常性に不可欠な器官です。涙液膜の水性部分を生成することにより、乾燥ストレスや外部からの侮辱から目を保護します。涙腺(病態)生理学については、適切な in vitro モデルがないため、ほとんど知られていません。オルガノイド技術は、複数の臓器にとって有用な実験プラットフォームとしての地位を証明しています。ここでは、涙腺生検から始まるマウスとヒトの涙腺オルガノイドを確立および維持するためのプロトコルを共有します。培養条件を変更することで、涙腺オルガノイドの機能を高めます。オルガノイドの機能は、涙腺オルガノイドを選択された神経伝達物質にさらして内腔の涙液放出を引き起こす「泣く」アッセイによって調べることができます。この現象を画像化して定量化する方法を説明します。涙腺恒常性における目的の遺伝子の役割を調べるために、これらを遺伝子組み換えすることができる。ガイドRNA設計からオルガノイドクローンジェノタイピングまで、ベースエディターを使用して涙腺オルガノイドを遺伝子改変する方法を徹底的に説明します。最後に、ヒト涙腺オルガノイドの再生能をマウスへの同所性移植により調べる方法を示します。この包括的なツールセットは、マウスとヒトの涙腺オルガノイドを使用して涙腺(病態)生理学を研究するためのリソースを提供します。
涙腺は、涙液膜1の水層の大部分を産生する腺上皮である。涙液膜の水層には、眼の表面を滑らかにする水だけでなく、眼の表面を感染から保護する抗菌成分のレパートリーも多く含まれています2。涙腺が損傷または炎症を起こすと、ドライアイ疾患が発生し、患者に不快感を与え、最終的には視力喪失につながる可能性があります3。何年にもわたって、涙腺、特にヒト腺を研究するためのモデルシステムは制限されてきました4、5、6。これは、生理学的および病理学的条件下での涙腺機能に関する知識のギャップに貢献しています。
最近、皿中の涙腺を研究するためにin vitroモデルが開発されました7,8,9。これらの涙腺オルガノイドは、in vitroで再生能力を維持する成長因子のカクテルを補充した細胞外マトリックス中で三次元構造として増殖した成体幹細胞に由来します7。成体幹細胞(ASC)由来のオルガノイドの利点は、健康な組織の特徴を再現しながら、非常に長期間維持できることです。このタイプのオルガノイドは、例えば間質細胞を含む可能性のある人工多能性幹細胞(iPSC)由来のオルガノイドとは異なり、上皮細胞のみで構成されています。多能性幹細胞(PSC)由来のオルガノイドとは異なり、ASCオルガノイドは成体組織から直接樹立され、拡張のための遺伝子改変を必要としません。ASCオルガノイドは成人の特徴を発現します10。
このプロトコルには、マウスおよびヒトの一次組織から涙腺オルガノイドを導出するためのツールボックスが含まれています。このプロトコルでは、単純な成長因子の回収によってオルガノイドの機能をさらに強化する方法と、膨潤アッセイを実行してオルガノイドを誘発して涙液を分泌させる方法について説明します。このプロトコルには、CRISPR由来のベースエディターを使用してマウスオルガノイドを遺伝子操作するためのエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法も含まれています。従来のCas9とは異なり、塩基エディターの使用は、二本鎖切断を生成することなくゲノム中の一塩基の改変を可能にする11,12。最後に、免疫不全マウスへのヒト涙腺オルガノイドの同所性移植とその後の生着の組織学的評価について説明します。この涙腺オルガノイドツールキットは、涙腺の再生と機能に関する研究、および遺伝および炎症性疾患のモデリングに使用できます。
このプロトコルは、機能アッセイ、突然変異モデリング、および移植のための涙腺オルガノイドの確立と使用について説明しています。マウスとヒトの涙腺オルガノイドを確立する場合、組織の解離は非常に重要です。組織が十分に消化されない場合、オルガノイド収量は低くなります。組織が過剰に消化されると、細胞は死に、オルガノイドとして成長しません。各組織は、最適なオルガノイドの伸長を確実にするために、特定の時間、特定の酵素で消化されるべきである14、17、18。涙腺は、ピペッティングベースの機械的解離と組み合わせた5〜10分のコラゲナーゼ消化が組織の小片を単離するのに十分である、かなり柔らかい組織である。シングルセルRNAシーケンシングなどのアプリケーションでシングルセルを取得する必要がある場合は、シングルセルステージに達するまで解離をより長く実行できますが、生存率の低下を制限するために、シングルセルが得られたらすぐに解離を停止する必要があります。組織の解離は非常に重要であるため、過剰消化が涙腺オルガノイドの確立の失敗の最も可能性の高い理由です。
涙腺オルガノイドの適切な維持は、それらの使用にとって重要である。長期維持は、人工多能性幹細胞由来オルガノイドと比較して、成体幹細胞由来涙腺オルガノイドの特徴である7,17。長期的なメンテナンスを達成するには、定期的なオルガノイド分割と培地交換を行う必要があります。これがないと、オルガノイドは分化し始め、幹細胞の可能性が低下し、長期的な維持を妨げます7。このステップでも、過剰消化は幹細胞を殺し、オルガノイドの維持を損なう可能性があります。定期的なメンテナンスのために、単一細胞へのオルガノイド解離は必要とされない。しかし、クローンノックアウトオルガノイド株を作製するには、まず単一細胞から始めることが重要です。そうでない場合、オルガノイドは異なる遺伝的背景を持つ細胞のモザイクで構成され、単一の定義された突然変異の影響を分析することは不可能です。ここでは、終止コドンを生成するためのC > Tベースエディタの使用について説明します。このゲノムエディターは、NGG PAMから12〜18塩基以内にアルギニン、グルタミン、またはトリプトファンコドンが存在することに依存しています。gRNAの設計においてこれらの条件が満たされない場合、代替PAMを有する従来のCas9またはC >T塩基エディターを使用することができる7,18。しかし、従来のCas9では、修理時にインデルが発生する二本鎖断線が導入されています11。両方の対立遺伝子が異なるインデルを持っている可能性があるため、クローンジェノタイピングには追加の注意が必要です。導入された修飾のデコンボリューションは、両方の対立遺伝子がフレーム外のインデルを含み、したがって、オルガノイドクローンが標的遺伝子に対してノックアウトされることを確実にするために実行する必要があります19。C > Tベースエディターの利点は、必ずしも終止コドンをもたらさない点突然変異をモデル化するために使用できるという事実にあります。たとえば、アニリジア患者に見られる特定のPax6変異をモデル化して、涙腺生理学への影響を研究するために使用できます20。
涙腺は涙液膜1の水性部分を分泌する。涙液分泌は、成長因子の離脱およびNOTCH阻害によって媒介される分化後のヒトオルガノイドにおいて再現され得る。これらの条件下では、オルガノイドは最終分化を受け、それ以上維持することはできません。しかし、分化した涙腺オルガノイドは、ドライアイ疾患の状況で、潜在的にハイスループットスクリーニングで涙を誘発する薬物の開発を導くことができます。このプロトコルで提示される引き裂きアッセイは、現在、短時間でオルガノイドサイズの最大の変化を与えるものであり、これにより、薬物スクリーニングのコンテキストで定量化することが容易になります7、9、17。
幹細胞療法は、ドライアイ疾患における涙腺再生に大きな期待を寄せています21。成体幹細胞由来の涙腺オルガノイドは、そのような用途の原料となる可能性があります。ここで提示されたプロトコルは、主に嚢胞として、ヒト涙腺オルガノイド生着をもたらします。オルガノイドの生着が低いのは、オルガノイドが間違った部位に注入されているためです。染料で注入手順をトレーニングすることで、注射部位の追跡が可能になり、最終的には注入精度が向上します。あるいは、マウスの表皮を切開して、22歳より前のラットで行われたように、涙腺に直接アクセスすることができます。この方法は時間がかかりますが、より正確になる場合があります。一方、本プロトコールでは、オルガノイドはマウスの涙腺に機能的に統合されなかった。同様の結果がiPS細胞由来涙腺生着についても観察されている22。移植方法は、事前に涙腺を創傷し、ドライアイマウスモデルを使用し、および/またはオルガノイドを単一細胞または小さな塊として注入することによってさらに改善される可能性があります。それにもかかわらず、成体幹細胞由来の涙腺オルガノイドおよび関連ツールキットは、涙腺研究および再生医療における将来の応用の基礎となる可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
プロトコルの初期開発についてYorick Postに感謝します。この研究の一部は、Cancer Research UK Grand Challenge(C6307/A29058)およびMark Foundation for Cancer ResearchからSPECIFICANCERチームへの賞によって支えられた。
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
BTXpress | BTX | MDS450805 | |
C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 – extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
DM4000 microscope | Leica | ||
dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
Fiji | NIH, Fiji developers | ||
Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
Hot plate | Meidax | ||
Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
LB medium | Hubrecht Institute | ||
MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
Microtome RM2235 | Leica | ||
Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
Water bath | Tulabo | ||
Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |