Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

Los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Real Academia de Artes y Ciencias de los Países Bajos (KNAW) bajo la licencia del proyecto AVD8010020151. Los organoides se derivaron del material excedente de ratón. Las biopsias de la glándula lagrimal humana se recogieron del material de desecho de pacientes sometidos a cirugía en el Centro Médico Universitario de Utrecht (UMCU) después de la aprobación del comité de ética médica bajo el protocolo número 18-740. El protocolo contiene varias secciones que se describen en la figura 1. Figura 1: Descripción general del protocolo. Esta figura destaca los diferentes pasos del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. NOTA: Todas las composiciones de medios y tampones se describen en la Tabla Suplementaria 1. 1. Establecimiento de organoides a partir de glándulas lagrimales humanas y de ratón Diseccionando la glándula lagrimal del ratónPrepare las herramientas de disección, incluidas las tijeras, los fórceps y las almohadillas de disección. Eutanasia de un ratón por inhalación deO2/CO2 13. Coloque el ratón sacrificado en su abdomen en la almohadilla de disección y fije sus extremidades. Mojar el pelo situado entre las orejas del ratón y en la frente con etanol al 70%. Usando tijeras de disección, haga una abertura detrás del cráneo entre las orejas. Extienda esta abertura sobre la frente hasta la nariz. Aún usando tijeras, corta la piel detrás de las orejas para generar dos colgajos. Tire de los colgajos hacia la nariz firmemente hasta que las glándulas lagrimales estén expuestas, como se muestra en la Figura 2A. Fije las solapas a la almohadilla de disección. Usando tijeras, haga una pequeña incisión en la membrana ubicada sobre la glándula lagrimal para exponer completamente la glándula lagrimal. Usando los fórceps, tire de la glándula lagrimal. Debe haber cierta resistencia hasta que se rompa el conducto lagrimal principal. Si lo prefiere, corte el conducto lagrimal principal directamente con tijeras. Coloque la glándula lagrimal del ratón en PBS de grado de cultivo tisular hasta su posterior procesamiento. Proceda con el procesamiento de la glándula lagrimal dentro de 2-4 h para limitar la muerte celular. Si esto toma más tiempo, coloque la glándula lagrimal del ratón en el medio de recolección de biopsia (Tabla suplementaria 1).NOTA: Se pueden agrupar varias glándulas lagrimales si se necesita un gran número de organoides de inmediato. Recolección de biopsias de glándulas lagrimales humanasAntes de la cirugía, prepare 20 ml de alícuotas de medio de recolección de biopsia (Tabla suplementaria 1) en un tubo de 50 ml, y déselo al cirujano antes de la cirugía. Este medio puede mantenerse a 4 °C durante varios meses. El día de la cirugía, deje que el cirujano tome una muestra de un pedazo de la glándula lagrimal (generalmente <1 mm3) y guárdelo en el medio de recolección de biopsia (Tabla suplementaria 1) a 4 °C. Recoger la biopsia para procesarla lo antes posible. Idealmente, esto debe ser el mismo día dentro de las 2 h de la muestra de biopsia. Derivación organoidePrepare de antemano lo siguiente: matriz extracelular (MCE) descongelada, ratón o medio de expansión humano (Tabla suplementaria 1) a temperatura ambiente (RT), colagenasa descongelada, medio base (Tabla suplementaria 1), dos bisturíes, una placa de Petri de 10 cm, un colador de 70 μm instalado en un tubo de 15 ml y placas de suspensión de 12 pocillos precalentadas a 37 °C durante 30 min. Preparar el medio de digestión combinando todos los componentes que se muestran en la Tabla Suplementaria 1. Moje previamente los bisturíes en este medio para evitar que las piezas de tejido se peguen a ellos. Recupere el tejido de la glándula lagrimal humana o del ratón del medio y colóquelo en la placa de Petri. Usando los bisturís prehumedecidos, pica el tejido. Una vez que las piezas de tejido sean muy pequeñas (es decir, <0.5 mm3), colóquelas en el medio de digestión raspándolas de la placa de Petri con el bisturí. Si la biopsia humana ya es muy pequeña, colóquela directamente en el medio de digestión sin picar para evitar la pérdida de tejido. Incubar las piezas de tejido durante un máximo de 15 minutos en un baño maría a 37 °C. Invierta el tubo de 15 ml regularmente para resuspender las piezas. Controle la disociación celular bajo un microscopio de sobremesa para no digerir demasiado el tejido. Mientras tanto, estrecha una pipeta Pasteur colocando su punta en una llama mientras gira, y humedécela previamente en el medio base. Para disociar eficientemente el tejido, asegúrese de que el orificio sea ligeramente más pequeño que las piezas más grandes de tejido que quedan. Para facilitar el proceso de disociación, pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo cada 5 minutos con la pipeta Pasteur estrechada prehumedecida. Cuando muchas células individuales y grupos pequeños son visibles bajo el microscopio, detenga la disociación agregando 10 ml del medio base. Girar a 400 x g durante 5 minutos para granular las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml del medio base para repetir el lavado. Filtrarlo a través de un colador de 70 μm para eliminar las grandes piezas de tejido no digerido y las fibras de colágeno restantes, lo que evitaría la polimerización adecuada de la ECM. Girar el eluido a 400 x g durante 5 min.NOTA: Un pellet de glóbulos rojos indica la presencia de glóbulos rojos, lo que normalmente no dificulta la derivación de organoides. Sin embargo, para algunas aplicaciones, como la citometría de flujo, los glóbulos rojos deben ser lisados. Para eso, incubar las células en 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos frescos en RT durante 5 min, y granular las células a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 100 μL de ECM fría para una sola glándula lagrimal de ratón y en 50 μL de ECM fría para una biopsia humana. Al resuspender, tenga cuidado de no hacer burbujas, ya que estas también afectarían la polimerización y estabilidad de ECM. Sembrar hasta 100 μL de células por pocillo de una placa de suspensión de 12 pocillos. Use un P200 para hacer gotitas de ~ 20 μL en el pozo. Cuanto más pequeñas sean las gotas, mejor será la difusión de los factores de crecimiento y nutrientes a través de la matriz. Coloque la placa boca abajo en una incubadora humidificada a 37 °C durante 20-30 min para permitir que la ECM se solidifique. Una vez que la ECM esté solidificada, agregue ~ 1 ml de ratón RT o medio de expansión humano por pocillo de una placa de 12 pocillos. Refresque el medio cada 2-3 días hasta que los organoides alcancen un tamaño de 300 μm. Para eso, aspire el medio en el pozo y agregue suavemente el medio de expansión en el lado del pozo sin tocar las gotas de ECM para no interrumpirlas.NOTA: La primocina (100 mg/ml; 1:1.000 de stock comercial) se puede añadir tras el aislamiento si se produce contaminación bacteriana. Sin embargo, debido a que también ralentiza el crecimiento de los organoides, es preferible no agregarlo o eliminarlo después de uno o dos pasajes. 2. Expansión de los organoides de ratón y glándula lagrimal humana Después de ~7 días para organoides de ratón y ~10 días para organoides humanos, cuando los organoides alcancen un tamaño de ~300 μm, retire el medio de cultivo. Resuspender las gotitas de ECM que contienen los organoides en 1 ml de solución de tripsina pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con un P1,000 hasta que las gotitas se desmoronen. Transfiera esta mezcla a un tubo de 15 ml e incube brevemente en un baño de agua a 37 °C. Después de 2-3 minutos, utilice una pipeta Pasteur estrecha y prehumedecida para subir y bajar la suspensión organoide 10x-15x. Verifique el estado de disociación de los organoides bajo un microscopio de sobremesa; Se deben obtener pequeños grupos de ~ 20 células. Incubar más tiempo en el baño maría a 37 °C y repetir el paso de pipeteo hasta que la disociación sea satisfactoria.NOTA: Este paso puede tomar más tiempo para los organoides humanos, ya que son de varias capas. Se generarán células individuales; Esto no afecta el crecimiento de organoides siempre que la mayor parte de la suspensión de organoides consista en pequeños grupos. Detenga la disociación agregando 10 ml del medio base. Luego, pellet las celdas a 400 x g durante 5 min. Después de retirar el sobrenadante y la MCE que pueda estar encima de los organoides (capa transparente, gelatinosa, sin organoides), resuspender las células en un volumen adecuado de MCE fría antes de colocarlas en una placa de suspensión, como se indica en el paso 1.3.10.NOTA: Generalmente, los organoides lagrimales de ratón se dividen en una proporción de 1:5 y los organoides humanos en una proporción de 1:3. Esto significa que, cuando se comienza con organoides contenidos en 100 μL de MEC, deben resuspenderse en 500 μL y 300 μL, respectivamente, después de la división. Incubar la placa boca abajo en una incubadora a 37 °C hasta la solidificación de la ECM durante 30 min, y cubrir los organoides con el ratón o el medio de expansión humano en RT. 3. Criopreservación de los organoides del ratón y de la glándula lagrimal humana Para criopreservar los organoides, primero divida los organoides en el medio de expansión de acuerdo con las instrucciones dadas en la sección 2. Aproximadamente 3-4 días después, cuando los organoides estén en una fase de crecimiento, retire el medio y resuspenda 100 μL de los organoides que contienen ECM en 10 ml de medio base frío. Incubar en hielo durante 10 minutos para ayudar a disociar la ECM. Voltee el tubo regularmente para facilitar este proceso. Pellet los organoides a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet organoide en 1 ml de medio de criopreservación (la ECM sobrante no perjudica la criopreservación). Transfiera la suspensión organoide a un criovial e inmediatamente a un congelador a -80 °C.NOTA: Cuando se utiliza el medio de criopreservación descrito en la Tabla de materiales, los crioviales se pueden mantener indefinidamente en un congelador de -80 °C. Si se utiliza otro medio de criopreservación, transfiera el criovial a un tanque de nitrógeno líquido después de 24 h para garantizar una conservación óptima. Para descongelar los organoides, recupere el criovial del congelador y transpótelo en hielo seco a un baño maría a 37 °C. Mantenga el criovial en el agua hasta que la mayor parte de su contenido se descongele. Transfiera el contenido a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de medio base y gire las células a 400 x g durante 5 min. Colocar los organoides en placa 100 μL de ECM con el medio de expansión, como se describe en los pasos 2.5 y 2.6. 4. Diferenciar los organoides de las glándulas lagrimales y evaluar su funcionalidad Diferenciación organoidePara diferenciar los organoides de la glándula lagrimal, primero divida los organoides en el medio de expansión de acuerdo con las instrucciones de la sección 2. Después de 2 días, sustituya el medio de expansión por un medio de diferenciación humano o de ratón, tal como se describe en el paso 1.3.12. Actualice el medio cada 2-3 días para mantener los organoides de ratón durante 5 días en ese medio y los organoides humanos durante 9 días. Para evaluar la diferenciación de organoides después de 5 días o 9 días en el medio de diferenciación, recolecte 100 μL de ECM que contenga organoides para extraer el ARN. Para ello, resuspenda las gotitas de ECM en 1 ml de medio contenido en el pozo utilizando un P1,000, y transfiera la suspensión organoide en 3 ml de medio base helado. Pellet los organoides a 500 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el tampón de extracción de ARN. Realice la extracción de ARN aguas abajo de acuerdo con las instrucciones del kit de extracción de ARN. Utilizar el ARN obtenido, por ejemplo, para el análisis RT-qPCR de la expresión de células madre (TP63, KRT5, KRT14) y marcadores celulares diferenciados (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2…) 14.NOTA: Para obtener el análisis de expresión pertinente, mida la expresión de los marcadores elegidos en una o varias muestras de tejido. Los organoides cultivados en condiciones de diferenciación tienden a contener menos ARN. Ensayo de hinchazón funcionalNOTA: Para esta parte del protocolo, use organoides de glándulas lagrimales humanas que se hayan diferenciado durante al menos 7 días. El tiempo mínimo requerido es de 7 días para garantizar una expresión suficiente del marcador para el desgarro funcional. Cada pocillo de una placa de 12 pocillos constituye una condición. El número mínimo de condiciones es tres: un control positivo, un control negativo y una condición de prueba.Preparar 1 ml de medio de diferenciación humano que contenga componentes individuales que induzcan la secreción por los organoides de la glándula lagrimal. Por ejemplo, agregue 100 μM de noradrenalina y 1 μM de forskolina, y mezcle bien.NOTA: La forskoline sirve como un control positivo que generalmente induce la hinchazón máxima. En un microscopio automatizado de lapso de tiempo de campo claro, configure las posiciones que se tomarán en la placa, el intervalo de tiempo (5 min) y la duración (4 h). Asegúrese de que una gota completa de ECM sea visible en cada posición. Inmediatamente antes de empezar a tomar imágenes y sin mover la placa del microscopio, retire el medio de cultivo de los pocillos de los que se tomará la imagen y sustitúyalo por el medio bien resuspendido preparado en el paso 4.2.1. Incluya como control negativo un pozo con medio de diferenciación reemplazado por medio de diferenciación solamente, ya que el refresco medio puede desencadenar cierta hinchazón organoide. Después de hasta 4 h, el ensayo de hinchazón ha terminado. Analizar los resultados.NOTA: Estos pasos se realizan con un microscopio EVOS M7000 que permite obtener imágenes automatizadas de lapso de tiempo de campo claro. Para ese microscopio, consulte el manual detallado del fabricante para configurar las imágenes de lapso de tiempo. Cabe destacar que se puede utilizar cualquier otro microscopio con características similares. Para cuantificar la hinchazón del organoide, medir el diámetro de cada organoide individual a las 0 h y 4 h. Abra las imágenes de una sola gota de organoide a las 0 h y 4 h en ImageJ. Haga clic en el icono Línea recta de la barra de herramientas y primero dibuje el diámetro de un organoide a las 0 h. A continuación, utilice la herramienta Medir en ImageJ (Analizar > medir) para medir la longitud de esta línea y, por lo tanto, el diámetro del organoide antes de hincharse. Repita el proceso en el mismo organoide a las 4 h para obtener el diámetro del organoide después de la hinchazón. Mida el diámetro del organoide de ~20 organoides por condición antes y después del ensayo de hinchazón. 5. Construir un plásmido para noquear a Pax6 Diseño de ARNg a knockout Pax6 usando editores base C > TNOTA: Hay muchos programas de software disponibles para el diseño de ARNg. Aquí, se utilizó Benchling, ya que esto permite el diseño integrado de ARNg, la anotación y la alineación de las trazas de Sanger. Por lo tanto, todos los pasos posteriores también se pueden realizar utilizando programas de software alternativos.Inicie el proceso de diseño de ARNg visualizando el gen objetivo en Benchling haciendo clic en Nuevo (+) > Secuencia de ADN > Importar secuencias de ADN. En la pestaña Importar desde base de datos, escriba el gen de interés, Pax6, y presione Buscar. Seleccione la compilación más reciente del genoma de referencia del ratón GRCm38 (mm10, Mus musculus) y pulse Importar. Seleccione el exón donde se puede diseñar el ARNg knock-out siguiendo las siguientes reglas:Evite poner un ARNg en el primer exón codificante, porque la célula puede usar sitios de inicio alternativos en exones posteriores para eludir el codón de parada inducido temprano. Diseñar ARNg en exones que estén presentes en todas las transcripciones alternativas que pueden ocurrir al empalmar el ARNm de Pax6 . Para garantizar esto, visualice Pax6 en el navegador del genoma Ensembl y seleccione el exón que se utiliza en todas las transcripciones. Para evitar aún más el empalme alternativo, apunte a un exón que tenga un codón incompleto (una o dos bases restantes de un triplete). Esto es de menor importancia, pero da más certeza sobre los efectos de los indeles inducidos. Para Pax6, el exón 4 al exón 11 son un buen objetivo. Además, elija un exón que contenga residuos de triptófano (W), glutamina (Q) o arginina (R).NOTA: Los editores de bases estándar C > T que utilizan SpCas9 tienen una ventana de edición que abarca desde el nucleótido 4 hasta el nucleótido 8 desde el inicio del ARNg (más lejos del PAM). Los editores de bases C > T pueden introducir codones de parada en todos los residuos de triptófano (W) (TGG a TGA, TAG o TAA) con un ARNg en la cadena inversa, en residuos de glutamina (Q) (CAG a TAG o CAA a TAA) y, por último, en residuos de arginina (R) (CGA a TGA) en la cadena delantera. Seleccione el exón + 20 bases aguas arriba y aguas abajo. Haga clic en el lado derecho de la pantalla en el signo de destino CRISPR y haga clic en Diseñar y Analizar guías. En el menú recién abierto, en la pestaña Tipo de diseño, marque las Guías para “edición base” (Komor et al., 2016). Mantenga la longitud de la guía en 20 nucleótidos y, en Genoma para ratón, seleccione GRCm38 (mm10, Mus musculus). Después de hacer clic en el signo verde + , el programa de software detectará automáticamente todas las secuencias de motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) y, en el lado derecho de la pantalla, creará una lista de todos los ARNg potenciales en el área alrededor del exón de interés. Desplácese por la lista hasta el signo de codón de parada (*) en un cuadro rojo, que indica un ARNg que potencialmente puede convertir un aminoácido en un codón de parada y, por lo tanto, resultar en un knock-out. En la primera columna a la derecha de la secuencia de ARNg, para cada objetivo “C” alrededor de la ventana de edición, se calculan las eficiencias de edición predichas in silico . Asegúrese de que la edición C > T que da como resultado el codón stop tenga una eficiencia de edición de al menos ~10. Haga clic en el valor de la columna Off-Target para comprobar a qué loci fuera del objetivo podría unirse el ARNg. Evite elegir un ARNg que se una a cualquier gen adicional para aumentar la especificidad. Por ejemplo, un buen gRNA para editar Pax6 con un editor base C > T apunta al exón 7 y es 5′-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3′. Cree una anotación en el archivo Benchling haciendo clic en el icono Anotaciones en la parte superior derecha de la pantalla, seguido de Nueva anotación. Asigne un nombre a la anotación y asegúrese de seleccionar la orientación correcta de ARNg en el menú desplegable Cadena. Generación de plásmidos de ARNgNOTA: Hay varios vectores disponibles para la entrega de ARNg en organoides. El siguiente plásmido se utilizó como base para la construcción de ARNg: pFYF1320 (Addgene #47511, un amable regalo de Keith Joung).Para clonar los gRNAs en pFYF1320, implemente una estrategia de PCR inversa utilizando el cebador directo estándar: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Para diseñar el cebador inverso, pegue el complemento inverso de la secuencia espaciadora de ARNg (verifique dos veces la orientación del ARNg [+ o – hebra]) delante de la siguiente parte universal del cebador inverso: CGGTGTGTGTCGTCCTTTCCACAAG. Para apuntar al exón 7 del ratón Pax6 usando el editor base C > T, el cebador inverso es el siguiente: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTGTGTCCTTTCCCCACAAG. Ordene ambas imprimaciones. Ejecute una reacción de PCR inversa utilizando 1 ng de pFYF1320 como plantilla utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad durante 35 ciclos a una temperatura de recocido de 61 °C. Ejecute la reacción de PCR en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE a 100 V durante ~ 45 min para visualizar el fragmento esperado de 2.281 pares de bases (pb). Realice una limpieza en gel utilizando el kit de su elección. Configure la siguiente reacción de ligadura: 100 ng de producto de PCR limpio, enzima Dpn1 para eliminar el ADN de plantilla inicial de pFYF1320 y ligasa T4. Incubar la mezcla durante 15 min a 20 °C, 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. Transformar la mezcla de reacción en bacterias DH5α químicamente competentes y esparcir las bacterias en placas de agar que contienen ampicilina15. Al día siguiente, escoja y expanda tres colonias individuales en 3 ml de caldo de lisogenia (LB) medio suplementado con 50 μg/ml de ampicilina. Al día siguiente, realice una minipreparación en 1 ml de cada uno de los tres minicultivos utilizando un kit de minipreparación y almacene el resto a 4 °C. Someter el plásmido obtenido a la secuenciación de Sanger con el cebador U6_Forward para asegurarse de que el ARNg se inserta correctamente en el vector16. Después de identificar una sola colonia bacteriana con el plásmido correcto, inocular 500 μL del minicultivo correspondiente en 50 ml de LB suplementado con ampicilina para amplificar el ADN plásmido durante la noche. Realice una preparación midi el día después de usar un kit de midiprep. Este plásmido se utilizará para la electroporación en la sección 6. 6. Generación de clones de Pax6 KO Electroporación organoideComience con organoides de ratón que se dividieron como máximo 5 días antes para que estén en un estado proliferativo. Use ~ 300-400 μL de gotas de organoides por knock-out. Incluya una condición adicional para seleccionar un control negativo que se electroporará sin ningún plásmido. Realice los pasos 2.1-2.4 para disociar los organoides, pero disocie los organoides por más tiempo para que sean células individuales. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 80 μL del tampón de electroporación. En un tubo de 1,5 ml, preparar los siguientes plásmidos para un máximo de 20 μL: 2,5 μg de plásmido pFYF1320-gRNA, 2,8 μg de plásmido que contiene transposasa, 7,2 μg de plásmido que contiene transposón resistente a la higrogicina y 7,5 μg de pCMV_ABEmax_P2A_GFP.NOTA: El plásmido pFYF1320-gRNA codifica el gRNA previamente diseñado, que guía el editor de bases al locus objetivo. El plásmido pCMV_ABEmax_P2A_GFP codifica el editor de bases, así como un reportero GFP, que se puede utilizar para monitorear las células que expresan el editor de bases después de la electroporación. El plásmido que contiene transposasa codifica la transposasa, que pega el casete de resistencia a la higromicina proporcionado por el plásmido que contiene transposón de resistencia a la higromicina en algún lugar al azar en el genoma. Las células que han incorporado este casete en su genoma se vuelven resistentes a la higromicina y pueden seleccionarse positivamente mediante la adición de higromicina. Como la co-incorporación de varios plásmidos es muy probable, la resistencia a la higrogicina constituye una selección funcional para enriquecer las células que han sido editadas para Pax6. Agregue los plásmidos a las células y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Configure el electroporador con los siguientes parámetros para el pulso de poro (voltaje: 175 V; longitud del pulso: 5 ms; intervalo de pulso: 50 ms; número de pulsos: 2; tasa de desintegración: 10%; polaridad: +) y para el pulso de transferencia (voltaje: 20 V; longitud del pulso: 50 ms; intervalo de pulso: 50 ms; número de pulsos: 5; tasa de desintegración: 40%; polaridad: +/-). Coloque las células con los plásmidos en una cubeta de electroporación. Mida inmediatamente la resistencia (Ω), que debe estar entre 0.30 A y 0.55 A, y electroporate de inmediato. Realizar este paso rápidamente es necesario para evitar que las células se asienten en la parte inferior de la cubeta y reduzcan la eficiencia de electroporación. Transfiera las células a un tubo de 1,5 ml y agregue 400 μL de tampón de electroporación complementado con un inhibidor de la Rho-quinasa. Permita que las células se recuperen a RT durante 30 minutos. Granular las células a 500 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y colocar las células en 200 μL de ECM. Después de la solidificación, agregue el medio de expansión del mouse. Los organoides quísticos crecen después de 2-3 días. Monitoree diariamente la señal GFP, que revela la presencia del editor base C > T. Selección de organoidesDespués de ~ 3 días, cuando los organoides se hayan recuperado, agregue 100 μg / ml de higromicina al medio de expansión del ratón para seleccionar los organoides que han integrado el casete de resistencia a la higromicina. Existe una alta probabilidad de que las células que absorben un plásmido absorban varios plásmidos. Al seleccionar organoides resistentes a la higromicina, se enriquecen los organoides editados en el locus Pax6 . Cuando todas las células en el control negativo están muertas y los organoides sobrevivientes son ~ 300 μm, elija los organoides resistentes a la higromicina. Selección de organoides y genotipadoPrepare puntas P20 estériles junto al microscopio y tubos de 1,5 ml que contengan 100 μL de solución de tripsina cada uno en hielo. Dobla una punta P20 con fórceps. Observe la placa que contiene los organoides sobrevivientes en un microscopio de sobremesa. Cuando un organoide sobreviviente esté enfocado, retire la tapa de la placa. Usando la punta P20 doblada y aún bajo el microscopio, aspire cada organoide sobreviviente individualmente y coloque cada uno de estos en un tubo separado que contenga solución de tripsina. Recoge hasta 20 clones. El número de clones a recoger depende del número de clones necesarios para cada diseño experimental y de la eficiencia de edición, que varía según cada ARNg y locus. Cuando se hayan recogido todos los clones, coloque los tubos de 1,5 ml en un baño maría a 37 °C durante un máximo de 5 minutos. Vortex cada tubo regularmente para aumentar la velocidad de disociación, y compruebe los organoides bajo el microscopio de sobremesa. Cuando los organoides se disocian en pequeños grupos y/o células individuales, detenga la digestión agregando 1 ml de medio base. Para cada clon seleccionado, mantenga ~ 400 μL para genotipar en un tubo separado de 1.5 ml. Girar los ~600 μL que quedan a 500 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante, resuspender las células en 20 μL de ECM, colocarlas como una sola gota en un pocillo de una placa de 24 pocillos y añadir medio de expansión de ratón sin higromicina. Para genotipar los clones, gire hacia abajo los tubos que contienen ~ 400 μL de suspensión celular a 500 x g durante 5 min, retire el sobrenadante y resuspenda las células en 50 μL de tampón de extracción de ADN para extraer el ADN. Incubar inmediatamente las células de la siguiente manera: 6 min a 60 °C, vórtice, y 4 min a 95 °C. Este ADN se puede mantener hasta 7 días a -20 °C, pero realizar la PCR posterior inmediatamente es lo más óptimo. Para amplificar el locus objetivo con la nucleasa, realice una PCR en 2 μL del ADN extraído utilizando cebadores de genotipado adecuados ordenados de antemano y una polimerasa de baja fidelidad. Los cebadores de genotipado son AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) y TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). El amplicón debe comenzar aproximadamente 100 pb desde el locus editado esperado para garantizar que se secuencie de manera eficiente. Ejecute el producto de PCR en un gel de agarosa para evaluar la eficacia de la PCR, como se mencionó en el paso 5.2.3. Cuando se detecte una banda del tamaño correcto, córtela del gel para realizar una extracción de gel de ADN utilizando un kit. Secuencie el ADN extraído de cada clon de organoide previamente recogido con los cebadores de genotipado. Alinear las secuencias obtenidas con el gen Pax6 en Benchling. Abra la secuencia de genes importados del paso 4.1. Haga clic en Alineaciones en el lado derecho y, a continuación, en Crear nueva alineación. Cargue los archivos .ab1 obtenidos del proveedor de secuenciación, seleccione ADN como tipo de nucleótido y pulse Siguiente. En la siguiente ventana, seleccione Multisecuencia y el programa de alineación Auto (MAFFT) antes de hacer clic en Crear alineación. Identificar los genotipos que tienen un codón de parada prematura homocigótica (como se obtiene con editores de base) en ambos alelos. Mantenga los clones de organoides correspondientes para expandirlos y criopreservarlos para su posterior análisis. Idealmente, se deben analizar tres clones de organoides diferentes uno al lado del otro para eludir los posibles efectos de nucleasa fuera del objetivo. 7. Trasplante ortotópico de organoides de la glándula lagrimal humana en ratones NSG Preparación de organoidesLos organoides de la glándula lagrimal humana deben dividirse ~ 3 días antes del día del trasplante, como se describe en la sección 2. El día del trasplante, asegúrese de que los organoides estén en la fase proliferativa para aumentar las posibilidades de injerto. Para extraer los organoides de la ECM, añadir dispasa al medio de cultivo para alcanzar una concentración final de 0,125 U/mL. Con un P1.000, resuspenda completamente las gotas de ECM para interrumpirlas y vuelva a colocar la placa en la incubadora de 37 °C durante 30 min. Un volumen de 100 μL de ECM es suficiente para inyectar ~10 glándulas lagrimales. Resuspender los organoides en 10 ml de medio base para lavar la enzima. Granular las células a 400 x g durante 5 min. Resuspender las células (~1,500,000) en 50 μL de medio de expansión humano frío suplementado con 5% de ECM. Coloque la suspensión organoide sobre hielo y proceda inmediatamente al trasplante. Trasplante ortotópico en ratonesEn la instalación para animales, coloque la suspensión organoide y las agujas de insulina en hielo. Aspirar la suspensión organoide en una aguja de insulina fría. Sedar un ratón inmunodeficiente con gamma (NSG) NOD con isoflurano al 3% para iniciar la anestesia. Cuando el ratón esté dormido, colóquelo rápidamente de lado con la glándula lagrimal principal (ubicada a medio camino entre el ojo y el oído) accesible. Inyecte 5 μL de la suspensión organoide directamente a través de la piel en la glándula lagrimal. El volumen máximo que puede contener una glándula lagrimal de ratón es de 5 μL. Permita que el ratón se recupere y monitoree el ratón todos los días para evaluar la presencia de cualquier molestia relacionada con el trasplante, especialmente en el ojo. Evaluar el injertoSacrificar el ratón con inhalación deO2/CO2 después de hasta 90 días, dependiendo de si se debe evaluar el injerto a corto o largo plazo13. Diseccionar la glándula lagrimal como se describe en la sección 1. Fijar en formalina al 4% durante 24 h en RT. Coloque la glándula lagrimal en un cassette. Deshidratar la glándula lagrimal incubándola de la siguiente manera: 2 h en etanol al 70%, 2 h en etanol al 96%, 1 h en etanol al 100% (2x), 2 h en xileno y durante la noche en parafina líquida a 58 °C en el horno. Al día siguiente, oriente la glándula lagrimal como se prefiera en un molde metálico, reméntela con parafina líquida y permita que el bloque se solidifique sobre una superficie fría. Este proceso se realiza mejor con una máquina de incrustación. Cuando el bloque de parafina esté sólido, corte todo el bloque en secciones de 4-5 μm con un micrótomo. Mantenga todas las secciones (en forma de cintas) en un ambiente seco y sin corrientes de aire. Las secciones se pueden mantener indefinidamente a temperatura ambiente. Muestree una de cada 10 secciones que abarcan todo el bloque.Monte las secciones en un tobogán de la siguiente manera: coloque una gota de agua en el tobogán, coloque la sección en la parte superior, déjela reposar durante ~ 2 minutos para permitir que se estire en una placa caliente a 42 ° C y retire el agua suavemente con papel. Colocar los portaobjetos a secar durante la noche en un horno a 58 °C. Las diapositivas se pueden mantener indefinidamente en RT más allá de esta etapa. Para distinguir las células humanas de las células de ratón, realice la tinción de antígenos nucleares humanos en estas secciones. Rehidratar las secciones realizando los siguientes lavados: 3 min en xileno (2x), 1 min en etanol al 100% (2x), 1 min cada uno en etanol al 96%, etanol al 90%, etanol al 80%, etanol al 70%, etanol al 60% y etanol al 25%, y finalmente, 1 min en agua demi (2x). Incubar las diapositivas durante 15 minutos en el búfer PO (Tabla suplementaria 1). Lave los toboganes 3 veces en agua ultrapura. Realizar una recuperación de antígenos basada en citrato en el autoclave:Coloque los portaobjetos en un portaportaobjetos a prueba de autoclave en una cesta llena de tampón de citrato (Tabla suplementaria 1). Coloque la cesta en el autoclave y ejecute un ciclo de autoclave (presión: 10 PSI; temperatura: 121 °C; tiempo: 15 min). Cuando el autoclave esté despresurizado, recupere la cesta que contiene los portaobjetos y colóquela en un baño de agua RT para llevar los portaobjetos a RT.NOTA: La estrategia de recuperación de antígenos depende del anticuerpo utilizado. Consulte la hoja de datos del proveedor para realizar la recuperación de antígenos más adecuada. Coloque los portaobjetos horizontalmente, con el lado de la sección hacia arriba, en una bandeja de incubación. Añadir 500 μL de tampón de bloqueo que contenga 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS en la parte superior, e incubar durante 1 h. Retire el búfer de bloqueo. Preparar la solución de anticuerpos añadiendo 1 μL de antígeno-anticuerpo nucleolar humano a 500 μL de tampón de bloqueo por portaobjetos a teñir. Agregue la solución de anticuerpos a cada portaobjetos. Incubar durante la noche en una bandeja de incubación humidificada a 4 °C. Al día siguiente, lave las diapositivas 3 veces en PBS. Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario HRP anti-ratón sin diluir durante 45 min. Lave las diapositivas 3 veces en PBS.CAUTELA. En una campana química, prepare el tampón DAB (Tabla suplementaria 1). Incubar las diapositivas con el búfer DAB durante 10 minutos. Deseche cualquier material de desecho en contenedores de desechos líquidos químicos orgánicos. Lave los toboganes con agua. Incubar los portaobjetos durante 2 min en hematoxilina para contrarrestar los núcleos. Lave los toboganes con agua corriente del grifo durante 10 minutos. Deshidrate los portaobjetos incubándolos durante 1 minuto cada uno en etanol al 50%, etanol al 60%, etanol al 70%, etanol al 80% y etanol al 90%, 1 minuto al etanol al 96% (2x), 1 minuto al etanol al 100% (2x) y 1 minuto al xileno (2x). Encierre las guías con un medio de montaje y un cubreobjetos. Después de secar durante unos 20 minutos, observe los portaobjetos bajo un microscopio.I>