Établissement, entretien, différenciation, manipulation génétique et transplantation d’organoïdes lacrymaux et humains

Les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Académie royale néerlandaise des arts et des sciences (KNAW) sous la licence de projet AVD8010020151. Les organoïdes ont été dérivés du surplus de matériel de souris. Les biopsies des glandes lacrymales humaines ont été collectées à partir des déchets de patients subissant une intervention chirurgicale au Centre médical universitaire d’Utrecht (UMCU) après approbation par le comité d’éthique médicale sous le numéro de protocole 18-740. Le protocole contient plusieurs sections qui sont décrites à la figure 1. Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole. Cette figure met en évidence les différentes étapes du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. REMARQUE : Toutes les compositions de milieu et de tampon sont décrites dans le tableau supplémentaire 1. 1. Établissement d’organoïdes à partir de glandes lacrymales de souris et humaines Disséquer la glande lacrymale de la sourisPréparez les outils de dissection, y compris les ciseaux, les pinces et les coussinets de dissection. Euthanasier une souris par inhalation O2/CO2 13. Placez la souris euthanasiée sur son abdomen sur le coussin de dissection et épinglez ses membres. Mouillez les cheveux situés entre les oreilles de la souris et sur le front en utilisant de l’éthanol à 70%. À l’aide de ciseaux à dissection, faites une ouverture derrière le crâne entre les oreilles. Étendez cette ouverture sur le front jusqu’au nez. Toujours à l’aide de ciseaux, coupez la peau derrière les oreilles pour générer deux volets. Tirez fermement les volets vers le nez jusqu’à ce que les glandes lacrymales soient exposées, comme le montre la figure 2A. Épinglez les rabats au tampon de dissection. À l’aide de ciseaux, faites une petite incision dans la membrane située au-dessus de la glande lacrymale pour exposer complètement la glande lacrymale. À l’aide des forceps, tirez sur la glande lacrymale. Il devrait y avoir une certaine résistance jusqu’à ce que le canal lacrymal principal soit déchiré. Si vous préférez, coupez le canal lacrymal principal directement avec des ciseaux. Placez la glande lacrymale de la souris dans du PBS de qualité culture tissulaire jusqu’à un traitement ultérieur. Procéder au traitement de la glande lacrymale dans les 2-4 heures pour limiter la mort cellulaire. Si cela prend plus de temps, placez la glande lacrymale de la souris dans le milieu de prélèvement de biopsie (tableau supplémentaire 1).REMARQUE: Plusieurs glandes lacrymales peuvent être mises en commun si un grand nombre d’organoïdes sont nécessaires immédiatement. Collecte de biopsies de glandes lacrymales humainesAvant la chirurgie, préparez 20 ml d’aliquotes de milieu de prélèvement de biopsie (tableau supplémentaire 1) dans un tube de 50 ml et donnez-les au chirurgien avant la chirurgie. Ce milieu peut être conservé à 4 °C pendant plusieurs mois. Le jour de la chirurgie, laisser le chirurgien prélever un morceau de glande lacrymale (habituellement <1 mm3) et le conserver dans le milieu de prélèvement de biopsie (tableau supplémentaire 1) à 4 °C. Prélevez la biopsie pour la traiter dès que possible. Idéalement, cela devrait être le même jour dans les 2 heures suivant le prélèvement de biopsie. Dérivation organoïdePréparez à l’avance les éléments suivants : matrice extracellulaire (MEC) décongelée, souris à température ambiante (RT) ou milieu d’expansion humain (tableau supplémentaire 1), collagénase décongelée, milieu de base (tableau supplémentaire 1), deux scalpels, une boîte de Petri de 10 cm, une crépine de 70 μm montée sur un tube de 15 ml et des plaques de suspension à 12 puits préchauffées à 37 °C pendant 30 min. Préparer le milieu de digestion en combinant tous les composants indiqués dans le tableau supplémentaire 1. Pré-mouiller les scalpels dans ce milieu pour éviter que des morceaux de tissu ne s’y collent. Récupérez le tissu de la souris ou de la glande lacrymale humaine du milieu et placez-le dans la boîte de Pétri. À l’aide des scalpels pré-mouillés, hacher le tissu. Une fois que les morceaux de tissu sont très petits (c.-à-d. <0,5 mm3), placez-les dans le milieu de digestion en les grattant de la boîte de Petri avec le scalpel. Si la biopsie humaine est déjà très petite, placez-la directement dans le milieu digestif sans hacher pour éviter la perte de tissu. Incuber les morceaux de tissu jusqu’à 15 min dans un bain-marie à 37 °C. Retourner régulièrement le tube de 15 ml pour remettre les morceaux en suspension. Surveillez la dissociation cellulaire au microscope de paillasse afin de ne pas trop digérer le tissu. Pendant ce temps, rétrécir une pipette Pasteur en plaçant son embout dans une flamme en tournant, et pré-mouiller dans le milieu de base. Pour dissocier efficacement le tissu, assurez-vous que le trou est légèrement plus petit que les plus gros morceaux de tissu restants. Pour faciliter le processus de dissociation, pipetez le mélange toutes les 5 minutes avec la pipette Pasteur rétrécie pré-mouillée. Lorsque de nombreuses cellules individuelles et de petits amas sont visibles au microscope, arrêtez la dissociation en ajoutant 10 mL du milieu de base. Faire tourner à 400 x g pendant 5 min pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL du milieu de base pour répéter le lavage. Filtrez-le à travers une passoire de 70 μm pour éliminer les gros morceaux de tissu non digérés et les fibres de collagène restantes, ce qui empêcherait une polymérisation adéquate de l’ECM. Faire tourner l’éluat à 400 x g pendant 5 min.REMARQUE: Une pastille de globules rouges indique la présence de globules rouges, ce qui n’entrave normalement pas la dérivation organoïde. Cependant, pour certaines applications, telles que la cytométrie en flux, les globules rouges doivent être lysés. Pour cela, incuber les cellules dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges frais à TA pendant 5 min, et granuler les cellules à 400 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL d’ECM froide pour une seule glande lacrymale de souris et dans 50 μL d’ECM froide pour une biopsie humaine. Lors de la remise en suspension, veillez à ne pas faire de bulles, car celles-ci affecteraient également la polymérisation et la stabilité de l’ECM. Ensemencer jusqu’à 100 μL de cellules par puits d’une plaque de suspension de 12 puits. Utilisez un P200 pour faire des gouttelettes de ~20 μL dans le puits. Plus les gouttelettes sont petites, meilleure est la diffusion des facteurs de croissance et des nutriments à travers la matrice. Placez la plaque à l’envers dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant 20-30 min pour permettre à l’ECM de se solidifier. Une fois l’ECM solidifié, ajouter ~1 mL de souris RT ou de milieu d’expansion humain par puits d’une plaque de 12 puits. Rafraîchir le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les organoïdes atteignent une taille de 300 μm. Pour cela, aspirez le milieu dans le puits, et ajoutez doucement le milieu d’expansion sur le côté du puits sans toucher les gouttelettes ECM pour ne pas les perturber.REMARQUE : La primocine (100 mg/mL; 1:1 000 provenant d’un stock commercial) peut être ajoutée lors de l’isolement en cas de contamination bactérienne. Cependant, comme il ralentit également la croissance organoïde, il est préférable de ne pas l’ajouter ou de le retirer après un ou deux passages. 2. Expansion des organoïdes de la souris et de la glande lacrymale humaine Après ~7 jours pour les organoïdes de souris et ~10 jours pour les organoïdes humains, lorsque les organoïdes atteignent une taille de ~300 μm, retirez le milieu de culture. Remettez en suspension les gouttelettes ECM contenant les organoïdes dans 1 mL de solution de trypsine en pipetant vigoureusement de haut en bas avec un P1 000 jusqu’à ce que les gouttelettes tombent en morceaux. Transférer ce mélange dans un tube de 15 ml et l’incuber brièvement dans un bain-marie à 37 °C. Après 2-3 min, utilisez une pipette Pasteur rétrécie et pré-mouillée pour pipeter la suspension organoïde de haut en bas de 10x-15x. Vérifier l’état de dissociation des organoïdes au microscope de paillasse; De petits amas de ~20 cellules doivent être obtenus. Incuber plus longtemps dans le bain-marie à 37 °C et répéter l’étape de pipetage jusqu’à ce que la dissociation soit satisfaisante.REMARQUE: Cette étape peut prendre plus de temps pour les organoïdes humains car ils sont multicouches. Des cellules individuelles seront générées; Cela n’affecte pas la croissance organoïde tant que la majeure partie de la suspension organoïde est constituée de petites touffes. Arrêter la dissociation en ajoutant 10 mL du milieu de base. Ensuite, pelleter les cellules à 400 x g pendant 5 min. Après avoir retiré le surnageant et la MEC qui peuvent se trouver sur les organoïdes (couche transparente ressemblant à de la gelée sans organoïdes), remettre les cellules en suspension dans un volume approprié d’ECM froide avant de les plaquer dans une plaque de suspension, comme indiqué à l’étape 1.3.10.REMARQUE: Généralement, les organoïdes lacrymaux de souris sont divisés à un rapport de 1: 5 et les organoïdes humains à un rapport de 1: 3. Cela signifie que, lorsqu’on commence avec des organoïdes contenus dans 100 μL d’ECM, ils doivent être remis en suspension dans 500 μL et 300 μL, respectivement, après la scission. Incuber la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 °C jusqu’à la solidification de l’ECM pendant 30 min, et recouvrir les organoïdes avec le milieu d’expansion souris ou humain à TA. 3. Cryoconservation des organoïdes de la souris et de la glande lacrymale humaine Pour cryoconserver les organoïdes, diviser d’abord les organoïdes dans le milieu d’expansion selon les instructions données au point 2. Environ 3-4 jours plus tard, lorsque les organoïdes sont en phase de croissance, retirer le milieu et remettre en suspension 100 μL de l’ECM contenant des organoïdes dans 10 mL de milieu de base froide. Incuber sur la glace pendant 10 minutes pour aider à dissocier l’ECM. Retournez le tube régulièrement pour faciliter ce processus. Enduire les organoïdes à 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille organoïde dans 1 mL de milieu de cryoconservation (les restes d’ECM ne nuisent pas à la cryoconservation). Transvaser la suspension organoïde dans un cryovial et immédiatement dans un congélateur à −80 °C.REMARQUE : Lors de l’utilisation du milieu de cryoconservation décrit dans le tableau des matériaux, les cryofioles peuvent être conservées indéfiniment dans un congélateur à −80 °C. Si un autre milieu de cryoconservation est utilisé, transférer le cryovial dans un réservoir d’azote liquide après 24 heures pour assurer une conservation optimale. Pour décongeler les organoïdes, récupérez le cryovial du congélateur et transportez-le sur glace sèche au bain-marie à 37 °C. Conserver le cryovial dans l’eau jusqu’à ce que la majeure partie de son contenu soit décongelée. Transférer le contenu dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu de base et faire tourner les cellules à 400 x g pendant 5 min. Plaquer les organoïdes dans 100 μL d’ECM avec le milieu d’expansion, comme décrit aux étapes 2.5 et 2.6. 4. Différencier les organoïdes des glandes lacrymales et évaluer leur fonctionnalité Différenciation organoïdePour différencier les organoïdes des glandes lacrymales, divisez d’abord les organoïdes dans le milieu d’expansion conformément aux instructions de la rubrique 2. Après 2 jours, remplacer le milieu d’expansion par un milieu de différenciation souris ou humain comme décrit à l’étape 1.3.12. Rafraîchir le milieu tous les 2-3 jours pour maintenir les organoïdes de souris pendant 5 jours dans ce milieu et les organoïdes humains pendant 9 jours. Pour évaluer la différenciation organoïde après 5 jours ou 9 jours dans le milieu de différenciation, prélever 100 μL d’ECM contenant des organoïdes pour extraire l’ARN. Pour ce faire, remettre en suspension les gouttelettes ECM dans 1 mL de milieu contenu dans le puits à l’aide d’un P1 000 et transférer la suspension organoïde dans 3 mL de milieu de base glacé. Enduire les organoïdes à 500 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un tampon d’extraction d’ARN. Effectuer l’extraction de l’ARN en aval selon les instructions du kit d’extraction d’ARN. Utiliser l’ARN obtenu, par exemple, pour l’analyse RT-qPCR de l’expression des cellules souches (TP63, KRT5, KRT14) et des marqueurs cellulaires différenciés (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2…) 14.NOTE: Pour obtenir l’analyse d’expression pertinente, mesurer l’expression des marqueurs choisis dans un ou plusieurs échantillons de tissus. Les organoïdes cultivés dans des conditions de différenciation ont tendance à contenir moins d’ARN. Dosage du gonflement fonctionnelNOTE: Pour cette partie du protocole, utilisez des organoïdes de glande lacrymale humaine différenciés depuis au moins 7 jours. Le temps minimum requis est de 7 jours pour assurer une expression suffisante du marqueur pour la déchirure fonctionnelle. Chaque puits d’une plaque de 12 puits constitue une condition. Le nombre minimum de conditions est de trois : un contrôle positif, un témoin négatif et une condition de test.Préparer fraîchement 1 mL de milieu de différenciation humain contenant des composants individuels qui induisent la sécrétion par les organoïdes de la glande lacrymale. Par exemple, ajoutez 100 μM de noradrénaline et 1 μM de forskoline, et mélangez bien.REMARQUE: La forskoline sert de contrôle positif qui induit généralement un gonflement maximal. À l’aide d’un microscope accéléré automatisé à fond clair, définissez les positions à imager dans la plaque, l’intervalle de temps (5 min) et la durée (4 h). Assurez-vous qu’une gouttelette ECM entière est visible à chaque position. Juste avant de commencer à imager et sans déplacer la plaque du microscope, retirez le milieu de culture des puits qui seront imagés et remplacez-le par le milieu bien remis en suspension préparé à l’étape 4.2.1. Inclure comme témoin négatif un puits avec un milieu de différenciation remplacé par un milieu de différenciation seulement, car un rafraîchissement moyen peut déclencher un gonflement organoïde. Après 4 heures maximum, le test de gonflement est terminé. Analysez les résultats.REMARQUE: Ces étapes sont effectuées avec un microscope EVOS M7000 qui permet l’imagerie accélérée automatisée en fond clair. Pour ce microscope, reportez-vous au manuel détaillé du fabricant pour configurer l’imagerie accélérée. Il convient de noter que tout autre microscope ayant des caractéristiques similaires peut être utilisé. Pour quantifier le gonflement organoïde, mesurer le diamètre de chaque organoïde individuel à 0 h et 4 h. Ouvrez les images d’une seule gouttelette organoïde à 0 h et 4 h dans ImageJ. Cliquez sur l’icône Ligne droite dans la barre d’outils et dessinez d’abord le diamètre d’un organoïde à 0 h. Ensuite, utilisez l’outil Mesure dans ImageJ (Analyser > Mesurer) pour mesurer la longueur de cette ligne et, par conséquent, le diamètre organoïde avant gonflement. Répéter le processus sur le même organoïde à 4 h pour obtenir le diamètre organoïde après gonflement. Mesurer le diamètre organoïde de ~20 organoïdes par condition avant et après le test de gonflement. 5. Construire un plasmide pour assommer Pax6 Conception de l’ARNg à l’élimination Pax6 utilisation des éditeurs de base C > TREMARQUE: Il existe de nombreux logiciels disponibles pour la conception d’ARNg. Ici, Benchling a été utilisé car cela permet la conception intégrée de l’ARNg, l’annotation et l’alignement des traces de Sanger. Toutes les étapes suivantes peuvent donc également être effectuées à l’aide de logiciels alternatifs.Démarrez le processus de conception de l’ARNg en visualisant le gène cible dans Benchling en cliquant sur Nouvelle (+) séquence d’ADN > > Importer des séquences d’ADN. Dans l’onglet Importer à partir d’une base de données, tapez le gène d’intérêt, Pax6, puis appuyez sur Rechercher. Sélectionnez la dernière version du génome de référence de la souris GRCm38 (mm10, Mus musculus) et appuyez sur Importer. Sélectionnez l’exon où l’ARNg knock-out peut être conçu en respectant les règles suivantes:Évitez de mettre un ARNg dans le premier exon codant, car des sites de départ alternatifs dans les exons suivants peuvent être utilisés par la cellule pour contourner le codon stop induit précocement. Concevoir des ARNg dans les exons qui sont présents dans tous les transcrits alternatifs qui peuvent se produire par épissage de l’ARNm Pax6 . Pour ce faire, visualisez Pax6 dans le navigateur de génomes Ensembl et sélectionnez l’exon utilisé dans tous les relevés de notes. Pour contourner davantage l’épissage alternatif, ciblez un exon qui a un codon incomplet (une ou deux bases restantes d’un triplet). Ceci est de moindre importance mais donne plus de certitude sur les effets des indels induits. Pour Pax6, l’exon 4 à l’exon 11 sont une bonne cible. En outre, choisissez un exon qui contient des résidus de tryptophane (W), de glutamine (Q) ou d’arginine (R).REMARQUE: Les éditeurs de base C > T standard qui utilisent SpCas9 ont une fenêtre d’édition qui s’étend du nucléotide 4 au nucléotide 8 à partir du début de l’ARNg (le plus éloigné du PAM). Les éditeurs de bases C > T peuvent introduire des codons stop sur tous les résidus de tryptophane (W) (TGG à TGA, TAG ou TAA) avec un ARNg sur le brin inverse, sur les résidus de glutamine (Q) (CAG à TAG ou CAA à TAA), et enfin, sur les résidus d’arginine (R) (CGA à TGA) sur le brin avant. Sélectionnez l’exon + 20 bases en amont et en aval. Cliquez sur le côté droit de l’écran sur le signe cible CRISPR, puis cliquez sur Guides de conception et d’analyse. Dans le menu nouvellement ouvert, sous l’onglet Type de conception, cochez les Guides pour l’édition de base (Komor et al., 2016). Gardez la longueur du guide à 20 nucléotides, et sous Génome pour la souris, sélectionnez GRCm38 (mm10, Mus musculus). Après avoir cliqué sur le signe + vert, le logiciel détectera automatiquement toutes les séquences de motifs adjacents protospacer (PAM) et, sur le côté droit de l’écran, créera une liste de tous les ARNg potentiels dans la zone autour de l’exon d’intérêt. Faites défiler la liste jusqu’au signe du codon d’arrêt (*) dans une boîte rouge, qui signale un ARNg qui peut potentiellement transformer un acide aminé en un codon d’arrêt et, par conséquent, entraîner un KO. Dans la première colonne à droite de la séquence d’ARNg, pour chaque cible « C » autour de la fenêtre d’édition, les efficacités d’édition prédites in silico sont calculées. Assurez-vous que l’édition C > T qui aboutit au codon d’arrêt a une efficacité d’édition d’au moins ~10. Cliquez sur la valeur dans la colonne Off-Target pour vérifier à quels loci hors cible l’ARNg pourrait se lier. Évitez de choisir un ARNg qui se lie à des gènes supplémentaires pour augmenter la spécificité. Par exemple, un bon ARNg pour éditer Pax6 avec un éditeur de base C > T cible l’exon 7 et est 5′-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3′. Créez une annotation dans le fichier Benchling en cliquant sur l’icône Annotations en haut à droite de l’écran, suivie de Nouvelle annotation. Nommez l’annotation et assurez-vous que la bonne orientation d’ARNg est sélectionnée dans le menu déroulant Strand . Génération de plasmides d’ARNgREMARQUE: Il existe différents vecteurs disponibles pour la livraison d’ARNg dans les organoïdes. Le plasmide suivant a été utilisé comme base pour la construction de l’ARNg: pFYF1320 (Addgene #47511, un cadeau aimable de Keith Joung).Pour cloner les ARNg dans pFYF1320, implémentez une stratégie de PCR inverse en utilisant l’amorce directe standard: « /5phos / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Pour concevoir l’amorce inverse, collez le complément inverse de la séquence d’espacement de l’ARNg (vérifiez l’orientation de l’ARNg [+ ou – brin]) devant la partie d’amorce inverse universelle suivante : CGGTGTTTCGTCCTTTCCAAG. Pour cibler l’exon 7 de la souris Pax6 à l’aide de l’éditeur de base C > T, l’amorce inverse est la suivante : TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCAAG. Commandez les deux amorces. Exécuter une réaction de PCR inverse en utilisant 1 ng de pFYF1320 comme matrice en utilisant une ADN polymérase haute fidélité pendant 35 cycles à une température de recuit de 61 °C. Exécutez la réaction de PCR sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TAE à 100 V pendant ~45 min pour visualiser le fragment attendu de 2 281 paires de bases (pb). Effectuez un nettoyage de gel à l’aide de la trousse de votre choix. Configurez la réaction de ligature suivante : 100 ng de produit PCR nettoyé, l’enzyme Dpn1 pour éliminer l’ADN modèle initial du pFYF1320 et la T4 ligase. Incuber le mélange pendant 15 min à 20 °C, 30 min à 37 °C et 20 min à 80 °C. Transformer le mélange réactionnel en bactéries DH5α chimiquement compétentes et étaler les bactéries sur des plaques de gélose contenant de l’ampicilline15. Le lendemain, cueillir et agrandir trois colonies individuelles dans 3 mL de bouillon lysogénique (LB) complété par 50 μg/mL d’ampicilline. Le lendemain, effectuez une miniprep sur 1 mL de chacune des trois mini-cultures à l’aide d’un kit miniprep, et conservez le reste à 4 °C. Soumettre le plasmide obtenu au séquençage de Sanger avec l’amorce U6_Forward pour s’assurer que l’ARNg est correctement inséré dans le vecteur16. Après avoir identifié une seule colonie bactérienne avec le bon plasmide, inoculer 500 μL de la mini-culture correspondante dans 50 mL de LB complétée par de l’ampicilline pour amplifier l’ADN plasmidique pendant la nuit. Effectuez une midi-prep le lendemain de l’utilisation d’un kit midiprep. Ce plasmide sera utilisé pour l’électroporation dans la section 6. 6. Génération de clones Pax6 KO Électroporation organoïdeCommencez par les organoïdes de souris qui ont été divisés au maximum 5 jours auparavant afin qu’ils soient dans un état prolifératif. Utilisez ~300-400 μL de gouttelettes organoïdes par knock-out. Inclure une condition supplémentaire pour la sélection d’un témoin négatif qui sera électroporé sans plasmide. Effectuez les étapes 2.1-2.4 pour dissocier les organoïdes, mais dissociez les organoïdes plus longtemps afin qu’ils soient des cellules uniques. Jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 80 μL du tampon d’électroporation. Dans un tube de 1,5 mL, préparer les plasmides suivants pour un maximum de 20 μL : 2,5 μg de plasmide pFYF1320-gRNA, 2,8 μg de plasmide contenant de la transposase, 7,2 μg de plasmide contenant des transposons résistants à l’hygromycine et 7,5 μg de pCMV_ABEmax_P2A_GFP.REMARQUE: Le plasmide pFYF1320-gRNA code l’ARNg précédemment conçu, qui guide l’éditeur de base vers le locus cible. Le plasmide pCMV_ABEmax_P2A_GFP code l’éditeur de base, ainsi qu’un rapporteur GFP, qui peut être utilisé pour surveiller les cellules qui expriment l’éditeur de base après l’électroporation. Le plasmide contenant la transposase code la transposase, qui colle la cassette de résistance à l’hygromycine fournie par le plasmide contenant un transposon de résistance à l’hygromycine quelque part au hasard dans le génome. Les cellules qui ont incorporé cette cassette dans leur génome deviennent résistantes à l’hygromycine et peuvent être sélectionnées positivement par l’ajout d’hygromycine. Comme la co-incorporation de plusieurs plasmides est très probable, la résistance à l’hygromycine constitue une sélection fonctionnelle à enrichir pour les cellules qui ont été éditées pour Pax6. Ajouter les plasmides aux cellules, et bien mélanger en pipetant de haut en bas. Configurez l’électroporateur avec les paramètres suivants pour l’impulsion de pores (tension: 175 V; longueur d’impulsion: 5 ms; intervalle d’impulsion: 50 ms; nombre d’impulsions: 2; taux de désintégration: 10%; polarité: +) et pour l’impulsion de transfert (tension: 20 V; longueur d’impulsion: 50 ms; intervalle d’impulsion: 50 ms; nombre d’impulsions: 5; taux de désintégration: 40%; polarité: +/-). Placer les cellules avec les plasmides dans une cuvette d’électroporation. Mesurez immédiatement la résistance (Ω), qui doit être comprise entre 0,30 A et 0,55 A, et électroportez immédiatement. Effectuer cette étape rapidement est nécessaire pour éviter que les cellules ne se déposent au fond de la cuvette et réduire l’efficacité de l’électroporation. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 mL et ajouter 400 μL de tampon d’électroporation complété par un inhibiteur de la rho-kinase. Laisser les cellules récupérer à TA pendant 30 min. Enduire les cellules à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et plaquer les cellules dans 200 μL d’ECM. Après solidification, ajouter le milieu d’expansion de la souris. Les organoïdes kystiques se développent après 2-3 jours. Surveillez quotidiennement le signal GFP, qui révèle la présence de l’éditeur de base C > T. Sélection organoïdeAprès ~3 jours, lorsque les organoïdes ont récupéré, ajouter 100 μg/mL d’hygromycine au milieu d’expansion de la souris pour sélectionner les organoïdes qui ont intégré la cassette de résistance à l’hygromycine. Il est fort probable que les cellules qui absorbent un plasmide en absorbent plusieurs. En sélectionnant des organoïdes résistants à l’hygromycine, les organoïdes édités sur le locus Pax6 sont enrichis. Lorsque toutes les cellules du contrôle négatif sont mortes et que les organoïdes survivants sont ~ 300 μm, choisissez les organoïdes résistants à l’hygromycine. Prélèvement et génotypage des organoïdesPréparer des pointes P20 stériles à côté du microscope et des tubes de 1,5 mL contenant 100 μL de solution de trypsine chacun sur de la glace. Pliez une pointe P20 avec une pince. Observez la plaque contenant les organoïdes survivants sur un microscope de paillasse. Lorsqu’un organoïde survivant est mis au point, retirez le couvercle de la plaque. À l’aide de la pointe P20 pliée et toujours au microscope, aspirez chaque organoïde survivant individuellement et placez chacun d’eux dans un tube séparé contenant une solution de trypsine. Choisissez jusqu’à 20 clones. Le nombre de clones à choisir dépend du nombre de clones requis pour chaque plan expérimental et de l’efficacité d’édition, qui varie en fonction de chaque ARNg et locus. Lorsque tous les clones ont été prélevés, placer les tubes de 1,5 ml dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 minutes maximum. Vortex chaque tube régulièrement pour augmenter la vitesse de dissociation, et vérifier les organoïdes sous le microscope de paillasse. Lorsque les organoïdes sont dissociés en petits amas et/ou en cellules individuelles, arrêtez la digestion en ajoutant 1 mL de milieu de base. Pour chaque clone choisi, conserver ~400 μL pour génotyper dans un tube séparé de 1,5 mL. Faire tourner les ~600 μL laissés à 500 x g pendant 5 min, retirer le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 20 μL d’ECM, les plaquer en une seule gouttelette dans un puits d’une plaque de 24 puits et ajouter le milieu d’expansion de souris sans hygromycine. Pour génotyper les clones, faites tourner les tubes contenant ~400 μL de suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 50 μL de tampon d’extraction d’ADN pour extraire l’ADN. Incuber immédiatement les cellules comme suit : 6 min à 60 °C, vortex, et 4 min à 95 °C. Cet ADN peut être conservé jusqu’à 7 jours à -20 °C, mais effectuer la PCR en aval immédiatement est le plus optimal. Pour amplifier le locus ciblé avec la nucléase, effectuer une PCR sur 2 μL de l’ADN extrait en utilisant des amorces de génotypage adéquates commandées au préalable et une polymérase basse fidélité. Les amorces du génotypage sont AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) et TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). L’amplicon doit démarrer à environ 100 pb du locus édité attendu pour s’assurer qu’il est séquencé efficacement. Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose pour évaluer l’efficacité de la PCR, comme mentionné à l’étape 5.2.3. Lorsqu’une bande de la bonne taille est détectée, découpez-la du gel pour effectuer une extraction de gel d’ADN à l’aide d’un kit. Séquencer l’ADN extrait de chaque clone organoïde préalablement choisi avec les amorces de génotypage. Aligner les séquences obtenues sur le gène Pax6 dans Benchling. Ouvrez la séquence génétique importée de l’étape 4.1. Cliquez sur Alignements sur le côté droit, puis sur Créer un nouvel alignement. Téléchargez les fichiers .ab1 obtenus auprès du fournisseur de séquençage, sélectionnez l’ADN comme type de nucléotide, puis appuyez sur Suivant. Dans la fenêtre suivante, sélectionnez Multiséquence et le programme d’alignement Auto (MAFFT) avant de cliquer sur Créer un alignement. Identifier les génotypes qui ont un codon stop prématuré homozygote (tel qu’obtenu avec les éditeurs de base) sur les deux allèles. Conservez les clones organoïdes correspondants pour les développer et cryopservez-les pour une analyse plus approfondie. Idéalement, trois clones organoïdes différents devraient être analysés côte à côte pour contourner les effets potentiels de la nucléase hors cible. 7. Transplantation orthotopique d’organoïdes de glande lacrymale humaine chez des souris NSG Préparation organoïdeLes organoïdes des glandes lacrymales humaines doivent être divisés ~3 jours avant le jour de la transplantation, comme décrit à la rubrique 2. Le jour de la transplantation, assurez-vous que les organoïdes sont en phase proliférative pour augmenter les chances de greffe. Pour extraire les organoïdes de l’ECM, ajouter de la dispase au milieu de culture pour atteindre une concentration finale de 0,125 U/mL. À l’aide d’un P1 000, remettre soigneusement en suspension les gouttelettes ECM pour les perturber et remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 30 minutes. Un volume de 100 μL d’ECM est suffisant pour injecter ~10 glandes lacrymales. Remettez les organoïdes en suspension dans 10 mL de milieu basique pour éliminer l’enzyme. Enduire les cellules à 400 x g pendant 5 min. Resuspendre les cellules (~1 500 000) dans 50 μL de milieu d’expansion humain froid supplémenté avec 5% ECM. Placez la suspension organoïde sur de la glace et procédez immédiatement à la transplantation. Transplantation orthotopique chez la sourisDans l’animalerie, ayez la suspension organoïde et les aiguilles d’insuline sur de la glace. Aspirer la suspension organoïde dans une aiguille à insuline froide. Sédatif une souris immunodéficiente NOD scid gamma (NSG) avec 3% d’isoflurane pour initier l’anesthésie. Lorsque la souris est endormie, placez-la rapidement sur le côté avec la glande lacrymale principale (située à mi-chemin entre l’œil et l’oreille) accessible. Injectez 5 μL de la suspension organoïde directement à travers la peau dans la glande lacrymale. Le volume maximal qu’une glande lacrymale de souris peut contenir est de 5 μL. Laissez la souris récupérer et surveillez la souris tous les jours pour évaluer la présence de tout inconfort lié à la transplantation, en particulier sur l’œil. Évaluer la greffeSacrifier la souris avec l’inhalation d’O 2 / CO2 après 90 jours selon que la greffe à court terme ou à long terme doit être évaluée13. Disséquer la glande lacrymale comme décrit à la section 1. Fixez-le dans du formol à 4% pendant 24 h à TA. Placez la glande lacrymale dans une cassette. Déshydrater la glande lacrymale en l’incubant comme suit : 2 h dans de l’éthanol à 70 %, 2 h dans de l’éthanol à 96 %, 1 h dans de l’éthanol à 100 % (2x), 2 h dans du xylène, et une nuit dans de la paraffine liquide à 58 °C au four. Le lendemain, orientez la glande lacrymale comme vous le souhaitez dans un moule métallique, complétez-la de paraffine liquide et laissez le bloc se solidifier sur une surface froide. Ce processus est mieux effectué avec une machine d’intégration. Lorsque le bloc de paraffine est solide, coupez le bloc entier en sections de 4-5 μm à l’aide d’un microtome. Conservez toutes les sections (en forme de rubans) dans un environnement sec et sans courant d’air. Les sections peuvent être conservées indéfiniment à température ambiante. Échantillonnez une section sur 10 couvrant l’ensemble du bloc.Montez les sections sur une lame comme suit: mettez une goutte d’eau sur la lame, placez la section sur le dessus, laissez-la reposer pendant ~ 2 minutes pour lui permettre de s’étirer sur une plaque chauffante à 42 ° C et retirez doucement l’eau avec du papier. Placer les lames à sécher pendant la nuit dans un four à 58 °C. Les diapositives peuvent être conservées indéfiniment à RT au-delà de ce stade. Pour distinguer les cellules humaines des cellules de souris, effectuez une coloration de l’antigène nucléaire humain sur ces sections. Réhydratez les sections en effectuant les lavages suivants : 3 min dans du xylène (2x), 1 min dans de l’éthanol 100% (2x), 1 min dans chacun dans de l’éthanol à 96%, 90% d’éthanol, 80% d’éthanol, 70% d’éthanol, 60% d’éthanol et 25% d’éthanol, et enfin, 1 min dans de l’eau demi (2x). Incuber les lames pendant 15 min dans un tampon PO (tableau supplémentaire 1). Lavez les lames 3x à l’eau ultrapure. Effectuer une récupération d’antigène à base de citrate dans l’autoclave :Placez les lames dans un support à lames résistant à l’autoclave dans un panier rempli de tampon de citrate (tableau supplémentaire 1). Placez le panier dans l’autoclave et exécutez un cycle d’autoclave (pression: 10 PSI; température: 121 °C; durée: 15 min). Lorsque l’autoclave est dépressurisé, récupérez le panier contenant les lames et placez-le dans un bain-marie RT pour amener les lames à RT.REMARQUE : La stratégie de récupération de l’antigène dépend de l’anticorps utilisé. Reportez-vous à la fiche technique du fournisseur pour effectuer le prélèvement d’antigène le plus adéquat. Placez les lames horizontalement, côté section vers le haut, sur un plateau d’incubation. Ajouter 500 μL de tampon bloquant contenant 1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS sur le dessus et incuber pendant 1 h. Retirez la mémoire tampon bloquante. Préparer la solution d’anticorps en ajoutant 1 μL d’antigène-antigène nucléolaire humain à 500 μL de tampon bloquant par lame à colorer. Ajouter la solution d’anticorps à chaque lame. Incuber pendant la nuit dans un bac d’incubation humidifié à 4 °C. Le lendemain, lavez les lames 3x dans PBS. Incuber les lames avec un anticorps secondaire anti-souris HRP non dilué pendant 45 min. Lavez les lames 3x dans PBS.PRUDENCE. Dans une hotte chimique, préparer le tampon DAB (tableau supplémentaire 1). Incuber les lames avec un tampon DAB pendant 10 min. Jetez tous les déchets dans des contenants de déchets liquides de produits chimiques organiques. Lavez les lames à l’eau. Incuber les lames pendant 2 min dans de l’hématoxyline pour contre-colorer les noyaux. Lavez les lames à l’eau courante du robinet pendant 10 min. Déshydratez les lames en les incubant pendant 1 min chacune dans de l’éthanol à 50 %, 60 % d’éthanol, 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol et 90 % d’éthanol, 1 min dans de l’éthanol à 96 % (2x), 1 min dans de l’éthanol à 100 % (2x) et 1 min dans du xylène (2x). Entourez les glissières d’un support de montage et d’une lamelle de couverture. Après séchage pendant environ 20 min, observez les lames au microscope.i>