Создание, поддержание, дифференциация, генетические манипуляции и трансплантация органоидов слезных желез мыши и человека

Эксперименты на мышах были одобрены Комитетом по этике животных Королевской академии искусств и наук Нидерландов (KNAW) по лицензии проекта AVD8010020151. Органоиды были получены из излишков материала мышей. Биопсия слезных желез человека была собрана из отходов пациентов, перенесших операцию в Университетском медицинском центре Утрехта (UMCU), после одобрения комитетом по медицинской этике в соответствии с протоколом No 18-740. Протокол содержит несколько разделов, которые показаны на рисунке 1. Рисунок 1: Обзор протокола. На этом рисунке показаны различные этапы протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. ПРИМЕЧАНИЕ: Все композиции сред и буферов описаны в Дополнительной таблице 1. 1. Создание органоидов из слезных желез мыши и человека Рассечение слезной железы мышиПодготовьте инструменты для вскрытия, включая ножницы, щипцы и подушечки для вскрытия. Усыпить мышь ингаляцией O2 / CO2 13. Положите усыпленную мышь на брюшко на подушечку для вскрытия и прижмите ее конечности. Намочите волосы, расположенные между ушами мыши и на лбу, используя 70% этанол. С помощью ножниц для рассечения сделайте отверстие за черепом между ушами. Расширьте это отверстие над лбом до носа. По-прежнему используя ножницы, разрежьте кожу за ушами, чтобы получились два лоскута. Сильно потяните лоскуты к носу, пока слезные железы не обнажаются, как показано на рисунке 2A. Пришпытрите створки к диссекционной подушечке. С помощью ножниц сделайте небольшой разрез в мембране, расположенной над слезной железой, чтобы полностью обнажить слезную железу. С помощью щипцов потяните слезную железу. Должно быть некоторое сопротивление до тех пор, пока главный слезный проток не разорвется. При желании разрежьте главный слезный проток непосредственно ножницами. Поместите слезную железу мыши в PBS для культивирования тканей до дальнейшей обработки. Приступают к обработке слезной железы в течение 2-4 ч, чтобы ограничить гибель клеток. Если это займет больше времени, поместите слезную железу мыши в среду для сбора биопсии (дополнительная таблица 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько слезных желез могут быть объединены, если немедленно требуется большое количество органоидов. Сбор биопсий слезных желез человекаПеред операцией подготовьте 20 мл аликвот среды для сбора биопсии (дополнительная таблица 1) в пробирке объемом 50 мл и передайте ее хирургу перед операцией. Эту среду можно выдерживать при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев. В день операции позвольте хирургу взять образец кусочка слезной железы (обычно <1 мм3) и хранить его в среде для сбора биопсии (дополнительная таблица 1) при температуре 4 ° C. Соберите биопсию, чтобы обработать ее как можно скорее. В идеале это должно быть в тот же день в течение 2 часов после забора биопсии. Органоидная деривацияЗаранее подготовьте следующее: размороженный внеклеточный матрикс (ECM), мышь комнатной температуры (RT) или среда расширения человека (Дополнительная таблица 1), размороженная коллагеназа, базовая среда (Дополнительная таблица 1), два скальпеля, одна чашка Петри 10 см, сетчатый фильтр 70 мкм, установленный на пробирке объемом 15 мл, и 12-луночные суспензионные пластины, предварительно нагретые при 37 ° C в течение 30 минут. Подготовьте среду для разложения, смешав все компоненты, указанные в дополнительной таблице 1. Предварительно смочите скальпели в этой среде, чтобы кусочки ткани не прилипли к ним. Извлеките ткань слезной железы мыши или человека из среды и поместите ее в чашку Петри. Используя предварительно смоченные скальпели, пропустите ткань через мясорубку. Как только кусочки ткани станут очень маленькими (т.е. <0,5мм3), поместите их в среду для разложения, соскоблив их с чашки Петри скальпелем. Если биопсия человека уже очень мала, поместите ее непосредственно в среду для пищеварения, не измельчая, чтобы избежать потери ткани. Инкубируйте кусочки ткани до 15 минут на водяной бане при температуре 37 °C. Регулярно переворачивайте пробирку объемом 15 мл, чтобы ресуспендировать кусочки. Следите за диссоциацией клеток под настольным микроскопом, чтобы не переварить ткань. Тем временем сузьте пипетку Пастера, поместив ее наконечник в пламя во время вращения, и предварительно смочите ее в основной среде. Чтобы эффективно диссоциировать ткань, убедитесь, что отверстие немного меньше, чем самые большие оставшиеся кусочки ткани. Чтобы облегчить процесс диссоциации, каждые 5 минут пипеткой «Пастер» пипеткой вверх и вниз пипеткой Пастера предварительно смачивается. Когда под микроскопом видно много одиночных клеток и небольших скоплений, остановите диссоциацию, добавив 10 мл основной среды. Отжимайте при 400 x g в течение 5 минут, чтобы гранулировать ячейки. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл основной среды, чтобы повторить стирку. Отфильтруйте его через ситечко 70 мкм, чтобы удалить большие непереваренные кусочки ткани и оставшиеся коллагеновые волокна, что предотвратит адекватную полимеризацию ECM. Отжим элюат при 400 х г в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула эритроцитов указывает на наличие эритроцитов, которые обычно не препятствуют образованию органоидов. Однако для некоторых применений, таких как проточная цитометрия, эритроциты должны быть лизированы. Для этого инкубируйте клетки в 5 мл свежего буфера для лизиса эритроцитов при RT в течение 5 мин и гранулируйте клетки при 400 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл холодного ECM для одной слезной железы мыши и в 50 мкл холодного ECM для биопсии человека. При ресуспендировании будьте осторожны, чтобы не образовывать пузырьки, так как это также может повлиять на полимеризацию и стабильность ECM. Засевают до 100 мкл клеток в лунку 12-луночной суспензионной пластины. Используйте P200, чтобы сделать ~ 20 мкл капель в лунке. Чем мельче капли, тем лучше диффузия факторов роста и питательных веществ через матрицу. Поместите тарелку вверх дном в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C на 20-30 минут, чтобы ECM затвердел. Как только ECM затвердеет, добавьте ~ 1 мл мыши RT или среды расширения человека на лунку из 12 лунок. Обновляйте среду каждые 2-3 дня, пока органоиды не достигнут размера 300 мкм. Для этого аспирируйте среду в лунку и аккуратно добавьте расширительную среду сбоку лунки, не касаясь капель ECM, чтобы не нарушить их.ПРИМЕЧАНИЕ: Примоцин (100 мг / мл; 1: 1000 из коммерческих запасов) может быть добавлен при выделении, если происходит бактериальное загрязнение. Однако, поскольку он также замедляет рост органоидов, предпочтительнее не добавлять его или удалять после одного или двух проходов. 2. Расширение органоидов слезных желез мыши и человека Через ~7 дней для органоидов мыши и ~10 дней для органоидов человека, когда органоиды достигнут размера ~300 мкм, удаляют питательную среду. Ресуспендируйте капли ECM, содержащие органоиды, в 1 мл раствора трипсина, энергично пипетируя вверх и вниз P1,000, пока капли не развалятся. Переложите эту смесь в пробирку объемом 15 мл и ненадолго инкубируйте на водяной бане с температурой 37 °C. Через 2-3 минуты с помощью суженной и предварительно смоченной пипетки Пастера пипетка для пипетки органоидной суспензии вверх и вниз в 10-15 раз. Проверить состояние диссоциации органоидов под настольным микроскопом; Следует получить небольшие скопления ~ 20 клеток. Выдерживайте дольше на водяной бане при температуре 37 °C и повторяйте этап пипетирования до тех пор, пока диссоциация не станет удовлетворительной.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять больше времени для органоидов человека, поскольку они многослойные. Будут сгенерированы отдельные ячейки; Это не влияет на органоидный рост, пока большая часть органоидной суспензии состоит из небольших комков. Остановите диссоциацию, добавив 10 мл основной среды. Затем гранулируйте ячейки в дозе 400 x g в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости и ECM, которые могут лежать поверх органоидов (прозрачный, желеобразный слой без органоидов), ресуспендируют клетки в соответствующем объеме холодного ECM перед нанесением покрытия в суспензионную пластину, как указано на шаге 1.3.10.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, слезные органоиды мыши разделяются в соотношении 1:5, а органоиды человека – в соотношении 1:3. Это означает, что при начале работы с органоидами, содержащимися в 100 мкл ECM, их необходимо ресуспендировать в 500 мкл и 300 мкл соответственно после расщепления. Инкубируйте пластину вверх дном в инкубаторе с температурой 37 °C до затвердевания ECM в течение 30 минут и накройте органоиды средой для расширения мыши или человека при RT. 3. Криоконсервация органоидов слезных желез мыши и человека Чтобы криоконсервировать органоиды, сначала разделите органоиды в расширяющей среде в соответствии с инструкциями, приведенными в разделе 2. Примерно через 3-4 дня, когда органоиды находятся в фазе роста, удалите среду и ресуспендируйте 100 мкл ECM, содержащих органоиды, в 10 мл среды с холодным основанием. Инкубируйте на льду в течение 10 минут, чтобы помочь диссоциировать ECM. Регулярно переворачивайте трубку, чтобы облегчить этот процесс. Гранулируйте органоиды в дозе 500 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте органоидную гранулу в 1 мл криоконсервирующей среды (остатки ECM не ухудшают криоконсервацию). Перенесите органоидную суспензию в криовальную камеру и сразу же в морозильную камеру с температурой -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании криоконсервационной среды, описанной в Таблице материалов, криовиалы можно хранить неограниченное время в морозильной камере с температурой -80 °C. Если используется другая криоконсервирующая среда, перенесите криовиал в резервуар с жидким азотом через 24 часа, чтобы обеспечить оптимальную сохранность. Чтобы разморозить органоиды, извлеките криовиал из морозильной камеры и транспортируйте его на сухом льду на водяную баню с температурой 37 °C. Держите криовиал в воде до тех пор, пока большая часть его содержимого не оттает. Перенесите содержимое в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл основной среды, и вращайте клетки при 400 x g в течение 5 мин. Поместите органоиды в 100 мкл ECM с расширяющей средой, как описано на шагах 2.5 и 2.6. 4. Дифференциация органоидов слезных желез и оценка их функциональности Дифференциация органоидовЧтобы дифференцировать органоиды слезных желез, сначала разделите органоиды в расширяющей среде в соответствии с инструкциями в разделе 2. Через 2 дня замените расширяющую среду мышью или средой для дифференциации человека, как описано в шаге 1.3.12. Обновляйте среду каждые 2-3 дня, чтобы поддерживать органоиды мыши в течение 5 дней в этой среде и органоиды человека в течение 9 дней. Чтобы оценить дифференцировку органоидов через 5 дней или 9 дней в дифференцировочной среде, соберите 100 мкл ECM, содержащих органоиды, для извлечения РНК. Для этого ресуспендируют капли ECM в 1 мл среды, содержащейся в лунке, используя P1,000, и переносят органоидную суспензию в 3 мл среды с ледяным основанием. Гранулируйте органоиды в дозе 500 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в буфере для экстракции РНК. Выполните последующую экстракцию РНК в соответствии с инструкциями набора для выделения РНК. Используйте полученную РНК, например, для анализа экспрессии стволовых клеток (TP63, KRT5, KRT14) и дифференцированных клеточных маркеров (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2…) 14.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить соответствующий анализ экспрессии, измерьте экспрессию выбранных маркеров в одном или нескольких образцах тканей. Органоиды, культивируемые в условиях дифференцировки, как правило, содержат меньше РНК. Анализ функционального отекаПРИМЕЧАНИЕ: Для этой части протокола используйте органоиды слезных желез человека, которые были дифференцированы в течение не менее 7 дней. Минимальное время, необходимое для обеспечения достаточной экспрессии маркера для функционального разрыва, составляет 7 дней. Каждая скважина 12-луночной плиты составляет одно условие. Минимальное количество условий — три: положительный контроль, отрицательный контроль и тестовое условие.Свежеприготовленный 1 мл среды для дифференцировки человека, содержащей отдельные компоненты, индуцирующие секрецию органоидами слезной железы. Например, добавьте 100 мкМ норадреналина и 1 мкМ форсколина и тщательно перемешайте.ПРИМЕЧАНИЕ: Форсколин служит положительным контролем, который обычно вызывает максимальный отек. На автоматизированном покадровом микроскопе светлого поля установите положения для изображения на пластине, временной интервал (5 мин) и продолжительность (4 ч). Убедитесь, что вся капля ECM видна в каждом положении. Непосредственно перед началом визуализации, не отрывая пластину от микроскопа, удалите питательную среду из лунок, которые будут визуализированы, и замените ее хорошо ресуспендированной средой, приготовленной на шаге 4.2.1. Включите в качестве отрицательного контроля лунку с дифференцировочной средой, замененной только дифференциирующей средой, так как освежение среды может вызвать некоторое набухание органоидов. По прошествии 4 ч анализ на отек заканчивается. Проанализируйте результаты.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги выполняются с помощью микроскопа EVOS M7000, который позволяет автоматически получать покадровую съемку светлого поля. Для этого микроскопа обратитесь к подробному руководству производителя, чтобы настроить покадровую съемку. Следует отметить, что можно использовать любой другой микроскоп с аналогичными характеристиками. Чтобы количественно оценить набухание органоидов, измерьте диаметр каждого отдельного органоида через 0 ч и 4 ч. Откройте изображения одной органоидной капли через 0 ч и 4 ч в ImageJ. Нажмите на значок «Прямая линия » на панели инструментов и сначала нарисуйте диаметр органоида при 0 h. Затем используйте инструмент «Измерение » в ImageJ (Анализ > измерение), чтобы измерить длину этой линии и, следовательно, диаметр органоида перед набуханием. Повторите процесс на том же органоиде через 4 ч, чтобы получить диаметр органоида после набухания. Измерьте диаметр органоида ~ 20 органоидов в каждом условии до и после анализа набухания. 5. Конструирование плазмиды для нокаута Pax6 Дизайн гРНК для нокаута Pax6 с использованием базовых редакторов C > TПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество программ для проектирования гРНК. Здесь был использован Benchling, поскольку он позволяет интегрировать дизайн гРНК, аннотацию и выравнивание следов Сэнгера. Таким образом, все последующие шаги также могут быть выполнены с помощью альтернативных программ.Начните процесс проектирования гРНК, визуализировав ген-мишень в Benchling, нажав « Создать» (+) > «Последовательность ДНК» > «Импортировать последовательности ДНК». На вкладке « Импорт из базы данных» введите интересующий ген Pax6 и нажмите «Поиск». Выберите новейшую сборку эталонного генома мыши GRCm38 (mm10, Mus musculus) и нажмите Import. Выберите экзон, в котором может быть сконструирована нокаутирующая гРНК, придерживаясь следующих правил:Избегайте помещения гРНК в первый кодирующий экзон, потому что альтернативные стартовые сайты в последующих экзонах могут использоваться клеткой для обхода раннего индуцированного стоп-кодона. Создавайте гРНК в экзонах, которые присутствуют во всех альтернативных транскриптах, которые могут происходить при сплайсинге мРНК Pax6 . Чтобы убедиться в этом, визуализируйте Pax6 в браузере генома Ensembl и выберите экзон, который используется во всех транскриптах. Чтобы еще больше обойти альтернативный сплайсинг, нацеливайтесь на экзон, который имеет неполный кодон (одно или два оставшихся основания триплета). Это имеет меньшее значение, но дает большую уверенность в эффектах индуцированных инделов. Для Pax6 экзон от 4 до экзона 11 являются хорошей мишенью. Кроме того, выберите экзон, содержащий остатки триптофана (W), глутамина (Q) или аргинина (R).ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные редакторы баз C > T, использующие SpCas9, имеют окно редактирования, которое охватывает от нуклеотида 4 до нуклеотида 8 от начала гРНК (наиболее удаленной от PAM). Редакторы C > Т-оснований могут вводить стоп-кодоны на все остатки триптофана (W) (TGG в TGA, TAG или TAA) с гРНК на обратной цепи, на остатках глутамина (Q) (CAG в TAG или CAA в TAA) и, наконец, на остатках аргинина (R) (CGA в TGA) на прямой цепи. Выберите экзон + 20 оснований вверх и вниз по течению. Нажмите в правой части экрана на целевой знак CRISPR и нажмите на руководства по проектированию и анализу. Во вновь открывшемся меню на вкладке « Тип дизайна» поставьте галочку напротив пункта «Руководства по базовому редактированию» (Komor et al., 2016). Сохраняйте длину направляющей на уровне 20 нуклеотидов и в разделе «Геном для мыши» выберите GRCm38 (mm10, Mus musculus). После нажатия на зеленый знак + программа автоматически обнаружит все последовательности смежных мотивов протоспейсера (PAM) и в правой части экрана создаст список всех потенциальных гРНК в области вокруг интересующего экзона. Прокрутите список до тех пор, пока в красном поле не появится знак стоп-кодона (*), который сигнализирует о наличии гРНК, которая потенциально может превратить аминокислоту в стоп-кодон и, таким образом, привести к нокауту. В первом столбце справа от последовательности гРНК для каждой мишени «C» вокруг окна редактирования вычисляется прогнозируемая эффективность редактирования in silico . Убедитесь, что редактирование C > T, которое приводит к стоп-кодону, имеет эффективность редактирования не менее ~ 10. Нажмите на значение в столбце Off-Target , чтобы проверить, с какими нецелевыми локусами может связываться гРНК. Избегайте выбора гРНК, которая связывается с какими-либо дополнительными генами для повышения специфичности. Например, хорошая гРНК для редактирования Pax6 с редактором оснований C > T нацелена на экзон 7 и представляет собой 5′-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3′. Создайте аннотацию в файле Benchling, щелкнув значок « Аннотации» в правом верхнем углу экрана, а затем « Новая аннотация». Назовите аннотацию и убедитесь, что в раскрывающемся меню «Цепь » выбрана правильная ориентация гРНК. Генерация плазмид гРНКПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные векторы, доступные для доставки гРНК в органоиды. В качестве основы для построения гРНК была использована следующая плазмида: pFYF1320 (Addgene #47511, добрый подарок от Кита Джунга).Чтобы клонировать гРНК в pFYF1320, реализуйте обратную стратегию ПЦР с использованием стандартного прямого праймера: «/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAAGGC. Чтобы разработать обратный праймер, вставьте обратный комплемент последовательности спейсера гРНК (дважды проверьте ориентацию гРНК [+ или – цепь]) перед следующей универсальной частью обратного праймера: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Чтобы нацелиться на экзон 7 мыши Pax6 с помощью базового редактора C > T, обратный праймер выглядит следующим образом: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Закажите оба грунтовки. Запустите обратную реакцию ПЦР с использованием 1 нг pFYF1320 в качестве матрицы с использованием высокоточной ДНК-полимеразы в течение 35 циклов при температуре отжига 61 °C. Запустите реакцию ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TAE при 100 В в течение ~ 45 мин, чтобы визуализировать ожидаемый фрагмент из 2,281 пары оснований (.н.). Выполните очистку гелем с помощью выбранного набора. Настройте следующую реакцию лигирования: 100 нг очищенного продукта ПЦР, фермент Dpn1 для удаления исходной матричной ДНК pFYF1320 и Т4-лигаза. Смесь инкубируют в течение 15 мин при 20 °C, 30 мин при 37 °C и 20 мин при 80 °C. Превратите реакционную смесь в химически компетентные бактерии DH5α и распределите бактерии по агаровым пластинам, содержащим ампициллин15. На следующий день соберите и разверните три отдельные колонии в 3 мл лизогенного бульона (LB) с добавлением 50 мкг / мл ампициллина. На следующий день проведите мини-подготовку по 1 мл каждой из трех мини-культур с помощью набора miniprep, а остальные храните при температуре 4 ° C. Подвергните полученную плазмиду секвенированию по Сэнгеру с U6_Forward праймером, чтобы убедиться, что гРНК правильно вставлена в вектор16. После идентификации одной бактериальной колонии с правильной плазмидой инокулируют 500 мкл соответствующей мини-культуры в 50 мл LB с добавлением ампициллина для амплификации плазмидной ДНК в течение ночи. Выполните миди-подготовку на следующий день после использования набора мидипреп. Эта плазмида будет использоваться для электропорации в разделе 6. 6. Генерация клонов Pax6 KO Электропорация органоидовНачните с органоидов мыши, которые были разделены не более чем за 5 дней до этого, чтобы они находились в пролиферативном состоянии. Используйте ~ 300-400 мкл органических капель на нокаут. Включите дополнительное условие для выбора отрицательного контроля, который будет электропорирован без какой-либо плазмиды. Выполните шаги 2.1-2.4, чтобы диссоциировать органоиды, но диссоциировать органоиды дольше, чтобы они были единичными клетками. Откажитесь от надосадочной жидкости. Ресуспендируют клетки в 80 мкл электропорационного буфера. В пробирке объемом 1,5 мл приготовьте следующие плазмиды максимум для 20 мкл: 2,5 мкг плазмиды pFYF1320-гРНК, 2,8 мкг транспозазосодержащей плазмиды, 7,2 мкг транспозонсодержащей плазмиды, резистентной к гигромицину, и 7,5 мкг pCMV_ABEmax_P2A_GFP.ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида pFYF1320-gRNA кодирует ранее разработанную гРНК, которая направляет редактор оснований к целевому локусу. Плазмида pCMV_ABEmax_P2A_GFP кодирует редактор оснований, а также репортер GFP, который можно использовать для мониторинга клеток, экспрессирующих редактор оснований после электропорации. Плазмида, содержащая транспозазу, кодирует транспозазу, которая случайным образом вставляет в геном кассету, устойчивую к гигромицину, обеспечиваемую транспозонсодержащей плазмидой с устойчивостью к гигромицину. Клетки, которые включили эту кассету в свой геном, становятся устойчивыми к гигромицину и могут быть положительно отобраны путем добавления гигромицина. Поскольку совместное включение нескольких плазмид весьма вероятно, резистентность к гигромицину представляет собой функциональный отбор для обогащения клеток, которые были отредактированы для Pax6. Добавьте плазмиды в клетки и хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз. Настройте электропоратор со следующими параметрами для порового импульса (напряжение: 175 В; длительность импульса: 5 мс; интервал импульсов: 50 мс; количество импульсов: 2; скорость затухания: 10%; полярность: +) и для передачи импульса (напряжение: 20 В; длина импульса: 50 мс; интервал импульсов: 50 мс; количество импульсов; скорость затухания: 40%; полярность: +/-). Поместите клетки с плазмидами в электропорационную кювету. Немедленно измерьте сопротивление (Ω), которое должно составлять от 0,30 А до 0,55 А, и сразу же электропорируйте. Быстрое выполнение этого шага необходимо, чтобы избежать оседания клеток на дне кюветы и снижения эффективности электропорации. Перенесите клетки в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 400 мкл электропорационного буфера с добавлением ингибитора Rho-киназы. Дайте клеткам восстановиться при ЛТ в течение 30 минут. Гранулируйте клетки в 500 x g в течение 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и поместите клетки в 200 мкл ECM. После застывания добавьте среду для расширения мыши. Кистозные органоиды вырастают через 2-3 дня. Ежедневно контролируйте сигнал GFP, который показывает наличие базового редактора C > T. Выбор органоидовЧерез ~ 3 дня, когда органоиды восстановятся, добавьте 100 мкг / мл гигромицина в среду расширения мыши, чтобы выбрать органоиды, которые интегрировали кассету резистентности к гигромицину. Существует высокая вероятность того, что клетки, занимающие одну плазмиду, займут несколько плазмид. Путем отбора органоидов, устойчивых к гигромицину, обогащаются отредактированные органоиды на локусе Pax6 . Когда все клетки в отрицательном контроле мертвы, а выжившие органоиды имеют размер ~ 300 мкм, выберите устойчивые к гигромицину органоиды. Сбор органоидов и генотипированиеПодготовьте стерильные наконечники P20 рядом с микроскопом и пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 100 мкл раствора трипсина на льду. Согните наконечник P20 щипцами. Понаблюдайте за пластиной, содержащей уцелевшие органоиды, под настольным микроскопом. Когда уцелевший органоид окажется в фокусе, снимите крышку пластины. Используя изогнутый наконечник P20 и все еще находясь под микроскопом, аспирируйте каждый выживший органоид по отдельности и поместите каждый из них в отдельную пробирку с раствором трипсина. Соберите до 20 клонов. Количество клонов, которые должны быть выбраны, зависит от количества клонов, необходимых для каждого экспериментального дизайна, и от эффективности редактирования, которая варьируется в зависимости от каждой гРНК и локуса. Когда все клоны будут отобраны, поместите пробирки объемом 1,5 мл на водяную баню с температурой 37 °C на срок до 5 минут. Регулярно вкручивайте каждую трубку, чтобы увеличить скорость диссоциации, и проверяйте органоиды под настольным микроскопом. Когда органоиды диссоциируют на небольшие скопления и/или отдельные клетки, остановите переваривание, добавив 1 мл основной среды. Для каждого выбранного клона храните ~ 400 мкл до генотипа в отдельной пробирке объемом 1,5 мл. Отжимите ~ 600 мкл, оставленный при 500 x g в течение 5 мин, удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в 20 мкл ECM, поместите их в виде одной капли в лунку 24-луночной пластины и добавьте среду для расширения мыши без гигромицина. Чтобы генотипировать клоны, раскрутите пробирки, содержащие ~ 400 мкл клеточной суспензии при 500 x g в течение 5 минут, удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 50 мкл буфера для экстракции ДНК для извлечения ДНК. Сразу же инкубируют клетки следующим образом: 6 мин при 60 °C, вихревых, и 4 мин при 95 °C. Эта ДНК может храниться до 7 дней при -20 ° C, но наиболее оптимальным является немедленное выполнение последующей ПЦР. Чтобы амплификировать локус, на который нацелена нуклеаза, проведите ПЦР на 2 мкл экстрагированной ДНК с использованием адекватных праймеров генотипирования, заказанных заранее, и полимеразы с низкой точностью. Праймерами для генотипирования являются AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) и TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Ампликон должен начинаться примерно на 100.н. от ожидаемого отредактированного локуса, чтобы обеспечить его эффективное секвенирование. Запустите продукт ПЦР на агарозном геле, чтобы оценить эффективность ПЦР, как указано на шаге 5.2.3. Когда будет обнаружена полоса правильного размера, вырежьте ее из геля, чтобы выполнить экстракцию геля ДНК с помощью набора. Секвенируйте извлеченную ДНК из каждого органоидного клона, ранее отобранного с помощью праймеров для генотипирования. Выровняйте полученные последовательности с геном Pax6 в Benchling. Откройте импортированную последовательность генов из шага 4.1. Нажмите « Выравнивание » справа, а затем « Создать новое выравнивание». Загрузите файлы .ab1, полученные от поставщика секвенирования, выберите ДНК в качестве типа нуклеотида и нажмите «Далее». В следующем окне выберите Multisequence и программу выравнивания Auto (MAFFT), прежде чем нажать « Создать выравнивание». Определите генотипы, которые имеют гомозиготный преждевременный стоп-кодон (полученный с помощью редакторов оснований) по обоим аллелям. Сохраните соответствующие клоны органоидов для расширения и криоконсервируйте их для дальнейшего анализа. В идеале три различных клонов органоидов должны быть проанализированы бок о бок, чтобы обойти потенциальные нецелевые эффекты нуклеазы. 7. Ортотопическая трансплантация органоидов слезных желез человека у мышей NSG Органоидная подготовкаОрганоиды слезных желез человека должны быть расщеплены ~ за 3 дня до дня трансплантации, как описано в разделе 2. В день трансплантации убедитесь, что органоиды находятся в пролиферативной фазе, чтобы увеличить шансы на приживление. Чтобы извлечь органоиды из ECM, добавьте диспазу в питательную среду до достижения конечной концентрации 0,125 Ед / мл. Используя P1,000, тщательно ресуспендируйте капли ECM, чтобы разрушить их, и поместите пластину обратно в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут. Объем 100 мкл ECM достаточен для инъекции ~10 слезных желез. Ресуспендируют органоиды в 10 мл основной среды, чтобы вымыть фермент. Гранулируйте ячейки в дозе 400 x g в течение 5 мин. Ресуспендировать клетки (~ 1 500 000) в 50 мкл холодной среды расширения человека с добавлением 5% ECM. Поместите органоидную суспензию на лед, и приступайте сразу к пересадке. Ортотопическая трансплантация у мышейВ животноводческом помещении держите органоидную суспензию и инсулиновые иглы на льду. Аспирируют органоидную суспензию в холодную инсулиновую иглу. Успокойте мышь с иммунодефицитом NOD scid гамма (NSG) 3% изофлураном, чтобы начать анестезию. Когда мышь спит, быстро положите ее на бок так, чтобы основная слезная железа (расположенная на полпути между глазом и ухом) была доступна. Вводят 5 мкл органоидной суспензии непосредственно через кожу в слезную железу. Максимальный объем, который может содержать слезная железа мыши, составляет 5 мкл. Дайте мышке восстановиться и наблюдайте за мышью каждый день, чтобы оценить наличие любого дискомфорта, связанного с трансплантацией, особенно на глазу. Оценить приживлениеПринесите мышь в жертву с ингаляцией O 2 / CO2 через 90 дней в зависимости от того, следует ли оценивать краткосрочное или долгосрочное приживление13. Рассеките слезную железу, как описано в разделе 1. Зафиксируйте его в 4% формалине в течение 24 ч при РТ. Поместите слезную железу в кассету. Обезвоживают слезную железу, инкубируя ее следующим образом: 2 ч в 70% этаноле, 2 ч в 96% этаноле, 1 ч в 100% этаноле (2x), 2 ч в ксилоле и в течение ночи в жидком парафине при 58 ° C в духовке. На следующий день сориентируйте слезную железу по своему усмотрению в металлической форме, долите в нее жидкий парафин и дайте блоку затвердеть на холодной поверхности. Этот процесс лучше всего выполнять с помощью встраивающей машины. Когда парафиновый блок станет твердым, разрежьте весь блок на участки размером 4-5 мкм с помощью микротома. Храните все срезы (в форме лент) в сухом месте без сквозняков. Срезы можно хранить неограниченное время при комнатной температуре. Выберите один из каждых 10 разделов, охватывающих весь блок.Установите секции на предметное стекло следующим образом: нанесите каплю воды на предметное стекло, поместите секцию сверху, дайте ей постоять ~ 2 минуты, чтобы она растянулась на плите с температурой 42 ° C, и аккуратно удалите воду бумагой. Поместите предметные стекла сушиться на ночь в духовку при температуре 58 °C. Слайды могут храниться на RT на неопределенный срок после этого этапа. Чтобы отличить клетки человека от клеток мыши, выполните окрашивание ядерного антигена человека на этих участках. Увлажните срезы, выполнив следующие промывки: 3 мин в ксилоле (2x), 1 мин в 100% этаноле (2x), по 1 мин в 96% этаноле, 90% этаноле, 80% этаноле, 70% этаноле, 60% этаноле и 25% этаноле и, наконец, 1 мин в демиводе (2x). Инкубируйте предметные стекла в течение 15 мин в буфере PO (дополнительная таблица 1). Промойте предметные стекла 3 раза в сверхчистой воде. Выполните извлечение антигена на основе цитрата в автоклаве:Поместите предметные стекла в держатель слайда, защищенный от автоклава, в корзину, заполненную цитратным буфером (дополнительная таблица 1). Поместите корзину в автоклав и запустите цикл автоклава (давление: 10 фунтов на квадратный дюйм; температура: 121 °C; время: 15 мин). Когда в автоклаве разгерметизируется, извлеките корзину с предметными стеклами и поместите ее в водяную баню RT, чтобы довести предметные стекла до RT.ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия извлечения антигена зависит от используемого антитела. Обратитесь к техническому описанию поставщика, чтобы выполнить наиболее адекватный поиск антигена. Поместите предметные стекла горизонтально, секцией вверх, на инкубационный лоток. Добавьте 500 мкл блокирующего буфера, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS сверху, и инкубируйте в течение 1 часа. Удалите блокирующий буфер. Приготовьте раствор антитела, добавив 1 мкл человеческого ядрышкового антигена-антитела к 500 мкл блокирующего буфера на предметное стекло, подлежащее окрашиванию. Добавьте раствор антител на каждый слайд. Инкубировать в течение ночи в увлажненном инкубационном лотке при температуре 4 °C. На следующий день промойте горки 3 раза в PBS. Инкубируйте предметные стекла с неразбавленным вторичным антителом HRP против мыши в течение 45 минут. Вымойте слайды 3 раза в PBS.ОСТОРОЖНОСТЬ. В химическом колпаке подготовьте буфер DAB (дополнительная таблица 1). Инкубируйте предметные стекла с буфером DAB в течение 10 минут. Выбросьте все отходы в контейнеры для органических химических жидких отходов. Промойте предметные стекла водой. Инкубируйте предметные стекла в течение 2 мин в гематоксилине, чтобы противопоставить ядрам. Промойте предметные стекла в проточной водопроводной воде в течение 10 минут. Обезвоживайте предметные стекла, инкубируя их в течение 1 минуты каждый в 50% этаноле, 60% этаноле, 70% этаноле, 80% этаноле и 90% этаноле, 1 мин в 96% этаноле (2x), 1 мин в 100% этаноле (2x) и 1 мин в ксилоле (2x). Закройте слайды монтажным материалом и покровным стеклом. После высыхания в течение примерно 20 минут наблюдайте за предметными стеклами под микроскопом.Я>