إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

تمت الموافقة على تجارب الفئران من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة للأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (KNAW) بموجب ترخيص المشروع AVD8010020151. تم اشتقاق المواد العضوية من المواد الفائضة للفئران. تم جمع خزعات الغدة الدمعية البشرية من فضلات المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية في المركز الطبي الجامعي في أوتريخت (UMCU) بعد موافقة لجنة الأخلاقيات الطبية بموجب البروتوكول رقم 18-740. يحتوي البروتوكول على عدة أقسام موضحة في الشكل 1. الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. يسلط هذا الشكل الضوء على الخطوات المختلفة للبروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ملاحظة: جميع التراكيب المتوسطة والعازلة موصوفة في الجدول التكميلي 1. 1. إنشاء عضويات من الفئران والغدد الدمعية البشرية تشريح الغدة الدمعية للفأرقم بإعداد أدوات التشريح ، بما في ذلك المقص والملقط ومنصات التشريح. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق O2 / CO2 13. ضع الفأر الرحيم على بطنه على وسادة التشريح ، وقم بتثبيت أطرافه. بلل الشعر الموجود بين آذان الماوس وعلى الجبهة باستخدام 70٪ إيثانول. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل فتحة خلف الجمجمة بين الأذنين. مد هذه الفتحة على الجبهة حتى الأنف. لا يزال يستخدم المقص ، وقطع الجلد خلف الأذنين لتوليد اثنين من اللوحات. اسحب السديلات باتجاه الأنف بقوة حتى تنكشف الغدد الدمعية، كما هو موضح في الشكل 2 أ. ثبت اللوحات على وسادة التشريح. باستخدام المقص ، قم بعمل شق صغير في الغشاء الموجود فوق الغدة الدمعية لكشف الغدة الدمعية تماما. باستخدام ملقط ، وسحب الغدة الدمعية. يجب أن يكون هناك بعض المقاومة حتى تمزق القناة الدمعية الرئيسية. إذا كنت تفضل ذلك ، قم بقطع القناة الدمعية الرئيسية مباشرة بالمقص. ضع الغدة الدمعية للفأر في برنامج تلفزيوني من درجة زراعة الأنسجة حتى تتم معالجة أخرى. المضي قدما في معالجة الغدة الدمعية في غضون 2-4 ساعات للحد من موت الخلايا. إذا استغرق ذلك وقتا أطول ، ضع الغدة الدمعية للفأر في وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1).ملاحظة: يمكن تجميع العديد من الغدد الدمعية إذا كانت هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الكائنات العضوية على الفور. جمع خزعات الغدة الدمعية البشريةقبل الجراحة ، قم بإعداد حصص 20 مل من وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1) في أنبوب سعة 50 مل ، وأعطها للجراح قبل الجراحة. يمكن الاحتفاظ بهذه الوسيلة عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر. في يوم الجراحة ، دع الجراح يأخذ عينة من قطعة من الغدة الدمعية (عادة <1 مم3) ، وقم بتخزينها في وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1) عند 4 درجات مئوية. جمع الخزعة لمعالجتها في أقرب وقت ممكن. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هذا في نفس اليوم خلال 2 ساعة من أخذ عينات الخزعة. الاشتقاق العضويقم بإعداد ما يلي مسبقا: مصفوفة مذابة خارج الخلية (ECM) ، فأر درجة حرارة الغرفة (RT) أو وسط تمدد بشري (الجدول التكميلي 1) ، كولاجيناز مذاب ، وسط أساسي (الجدول التكميلي 1) ، مشرطان ، طبق بتري 10 سم ، مصفاة 70 ميكرومتر مثبتة على أنبوب سعة 15 مل ، وألواح تعليق 12 بئرا مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تحضير وسط الهضم من خلال الجمع بين جميع المكونات الموضحة في الجدول التكميلي 1. بلل المشارط مسبقا في هذه الوسيلة لتجنب التصاق قطع الأنسجة بها. استرجع أنسجة الفأر أو الغدة الدمعية البشرية من الوسط ، وضعها في طبق بتري. باستخدام المشارط المبللة مسبقا ، قم بفرم الأنسجة. بمجرد أن تصبح قطع الأنسجة صغيرة جدا (أي <0.5 مم3) ، ضعها في وسط الهضم عن طريق كشطها من طبق بتري بالمشرط. إذا كانت الخزعة البشرية صغيرة جدا بالفعل ، فضعها مباشرة في وسط الهضم دون فرمها لتجنب فقدان الأنسجة. احتضان قطع المناديل لمدة تصل إلى 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. اقلب الأنبوب سعة 15 مل بانتظام لإعادة تعليق القطع. راقب تفكك الخلايا تحت مجهر منضدة حتى لا تفرط في هضم الأنسجة. في غضون ذلك ، قم بتضييق ماصة باستور عن طريق وضع طرفها في اللهب أثناء الدوران ، وقم بترطيبها مسبقا في الوسط الأساسي. لفصل الأنسجة بكفاءة ، تأكد من أن الثقب أصغر قليلا من أكبر قطع الأنسجة المتبقية. لتسهيل عملية التفكك ، قم بسحب الخليط لأعلى ولأسفل كل 5 دقائق باستخدام ماصة باستور الضيقة المبللة مسبقا. عندما تكون العديد من الخلايا المفردة والكتل الصغيرة مرئية تحت المجهر ، أوقف التفكك بإضافة 10 مل من الوسط الأساسي. تدور لأسفل في 400 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من الوسط الأساسي لتكرار الغسيل. قم بترشيحه من خلال مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة قطع الأنسجة الكبيرة غير المهضومة وألياف الكولاجين المتبقية ، مما يمنع البلمرة الكافية ل ECM. أدر الشطف عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.ملاحظة: تشير حبيبات الخلايا الحمراء إلى وجود خلايا الدم الحمراء ، والتي عادة لا تعيق اشتقاق الكائنات العضوية. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض التطبيقات ، مثل قياس التدفق الخلوي ، يجب تحليل خلايا الدم الحمراء. لذلك ، احتضان الخلايا في 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء الطازجة في RT لمدة 5 دقائق ، وحبيبات الخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من ECM البارد للغدة الدمعية لفأر واحد وفي 50 ميكرولتر من ECM البارد لخزعة بشرية. عند إعادة الضبط ، كن حذرا حتى لا تصنع فقاعات ، لأنها ستؤثر أيضا على بلمرة ECM واستقرارها. بذر ما يصل إلى 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر من لوحة تعليق 12 بئرا. استخدم P200 لعمل قطرات ~ 20 ميكرولتر في البئر. كلما كانت القطرات أصغر ، كان انتشار عوامل النمو والمواد المغذية أفضل من خلال المصفوفة. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة مرطبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح ل ECM بالتصلب. بمجرد ترسيخ ECM ، أضف ~ 1 مل من ماوس RT أو وسيط التمدد البشري لكل بئر من 12 لوحة بئر. قم بتحديث الوسط كل 2-3 أيام حتى تصل المواد العضوية إلى حجم 300 ميكرومتر. لذلك ، قم بشفط الوسط في البئر ، وأضف وسط التمدد برفق على جانب البئر دون لمس قطرات ECM حتى لا تعطلها.ملاحظة: يمكن إضافة بريموسين (100 مجم / مل ؛ 1: 1000 من المخزون التجاري) عند العزل في حالة حدوث تلوث بكتيري. ومع ذلك ، نظرا لأنه يبطئ نمو الأعضاء أيضا ، فمن الأفضل عدم إضافته أو إزالته بعد مرور واحد أو مقطعين. 2. توسيع الفأر وعضويات الغدة الدمعية البشرية بعد ~ 7 أيام لعضويات الماوس و ~ 10 أيام للعضويات البشرية ، عندما تصل المواد العضوية إلى حجم ~ 300 ميكرومتر ، قم بإزالة وسط الاستزراع. أعد تعليق قطرات ECM التي تحتوي على المواد العضوية في 1 مل من محلول التربسين عن طريق السحب بقوة لأعلى ولأسفل باستخدام P1,000 حتى تنهار القطرات. انقل هذا الخليط إلى أنبوب سعة 15 مل ، واحتضنه لفترة وجيزة في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد 2-3 دقائق ، استخدم ماصة باستور الضيقة والمبللة مسبقا لسحب التعليق العضوي لأعلى ولأسفل 10x-15x. تحقق من حالة تفكك المواد العضوية تحت المجهر على الطاولة ؛ يجب الحصول على كتل صغيرة من ~ 20 خلية. احتضن لفترة أطول في حمام مائي 37 درجة مئوية ، وكرر خطوة السحب حتى يصبح التفكك مرضيا.ملاحظة: قد تستغرق هذه الخطوة وقتا أطول للعضويات البشرية لأنها متعددة الطبقات. سيتم إنشاء خلايا مفردة. هذا لا يؤثر على النمو العضوي طالما أن معظم تعليق العضو يتكون من كتل صغيرة. أوقف التفكك بإضافة 10 مل من الوسط الأساسي. ثم, بيليه الخلايا في 400 × غرام لمدة 5 دقائق. بعد إزالة المادة الطافية و ECM التي قد توضع فوق المواد العضوية (طبقة شفافة تشبه الهلام بدون عضويات) ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من ECM البارد قبل الطلاء في لوحة تعليق ، كما هو موضح في الخطوة 1.3.10.ملاحظة: بشكل عام ، يتم تقسيم الكائنات العضوية الدمعية للفأر بنسبة 1: 5 والكائنات العضوية البشرية بنسبة 1: 3. هذا يعني أنه عند البدء بالمواد العضوية الموجودة في 100 ميكرولتر من ECM ، يجب إعادة تعليقها في 500 ميكرولتر و 300 ميكرولتر ، على التوالي ، بعد الانقسام. احتضن اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصلب ECM لمدة 30 دقيقة ، وقم بتغطية الكائنات العضوية بالماوس أو وسط التمدد البشري في RT. 3. حفظ الفئران وعضويات الغدة الدمعية البشرية بالتبريد للحفاظ على المواد العضوية بالتبريد ، قم أولا بتقسيم الكائنات العضوية في وسط التمدد وفقا للتعليمات الواردة في القسم 2. بعد حوالي 3-4 أيام ، عندما تكون الكائنات العضوية في مرحلة النمو ، قم بإزالة الوسط ، وأعد تعليق 100 ميكرولتر من المواد العضوية المحتوية على ECM في 10 مل من وسط القاعدة الباردة. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق للمساعدة في فصل ECM. اقلب الأنبوب بانتظام لتسهيل هذه العملية. بيليه المواد العضوية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات العضوية في 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد (بقايا ECM لا تضعف الحفظ بالتبريد). انقل المعلق العضوي إلى المبرد وعلى الفور إلى الفريزر -80 درجة مئوية.ملاحظة: عند استخدام وسيط الحفظ بالتبريد الموصوف في جدول المواد ، يمكن الاحتفاظ بالتبريد إلى أجل غير مسمى في مجمد -80 درجة مئوية. إذا تم استخدام وسيط آخر للحفظ بالتبريد ، فقم بنقل المبرد إلى خزان النيتروجين السائل بعد 24 ساعة لضمان الحفظ الأمثل. لإذابة المواد العضوية ، استرجع المبرد من الفريزر ، وانقله على ثلج جاف إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. امسك المبرد في الماء حتى تذوب معظم محتوياته. انقل المحتويات إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من الوسط الأساسي ، وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. قم بطلاء المواد العضوية في 100 ميكرولتر من ECM بوسط التمدد ، كما هو موضح في الخطوة 2.5 والخطوة 2.6. 4. التمييز بين عضويات الغدة الدمعية وتقييم وظائفها التمايز العضويللتمييز بين عضويات الغدة الدمعية ، قم أولا بتقسيم الكائنات العضوية في وسط التمدد وفقا للتعليمات الواردة في القسم 2. بعد يومين، استبدل وسيط التمدد بالماوس أو وسيط التمايز البشري كما هو موضح في الخطوة 1.3.12. قم بتحديث الوسط كل 2-3 أيام للحفاظ على عضويات الماوس لمدة 5 أيام في هذا الوسط والكائنات العضوية البشرية لمدة 9 أيام. لتقييم التمايز العضوي بعد 5 أيام أو 9 أيام في وسط التمايز ، اجمع 100 ميكرولتر من ECM تحتوي على عضويات لاستخراج الحمض النووي الريبي. للقيام بذلك ، أعد تعليق قطرات ECM في 1 مل من الوسط الموجود في البئر باستخدام P1,000 ، ونقل التعليق العضوي في 3 مل من وسط قاعدة الجليد البارد. بيليه المواد العضوية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي في اتجاه مجرى النهر وفقا لتعليمات مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي. استخدم الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه ، على سبيل المثال ، لتحليل RT-qPCR للتعبير عن الخلايا الجذعية (TP63 ، KRT5 ، KRT14) وعلامات الخلايا المتمايزة (LCN2 ، WFDC2 ، AQP5 ، LTF ، ACTA2 …) 14.ملاحظة: للحصول على تحليل التعبير ذي الصلة ، قم بقياس تعبير العلامات المختارة في عينة واحدة أو عدة عينات من الأنسجة. تميل المواد العضوية المستزرعة في ظل ظروف التمايز إلى احتواء كمية أقل من الحمض النووي الريبي. مقايسة التورم الوظيفيملاحظة: بالنسبة لهذا الجزء من البروتوكول ، استخدم عضويات الغدة الدمعية البشرية التي تم تمييزها لمدة 7 أيام على الأقل. الحد الأدنى للوقت المطلوب هو 7 أيام لضمان تعبير علامة كافية للتمزق الوظيفي. يشكل كل بئر من صفيحة 12 بئرا شرطا واحدا. الحد الأدنى لعدد الشروط هو ثلاثة: عنصر تحكم إيجابي ، وتحكم سلبي ، وحالة اختبار.تحضير طازج 1 مل من وسط التمايز البشري الذي يحتوي على مكونات فردية تحفز إفراز عضويات الغدة الدمعية. على سبيل المثال ، أضف 100 ميكرومتر نورادرينالين و 1 ميكرومتر فورسكولين ، واخلطها جيدا.ملاحظة: فورسكولين بمثابة السيطرة الإيجابية التي عادة ما تؤدي إلى أقصى قدر من التورم. في مجهر الفاصل الزمني الآلي برايت فيلد ، قم بإعداد المواضع المراد تصويرها في اللوحة ، والفاصل الزمني (5 دقائق) ، والمدة (4 ساعات). تأكد من أن قطرة ECM كاملة مرئية في كل موضع. قبل البدء في التصوير مباشرة ودون تحريك اللوحة من المجهر ، قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار التي سيتم تصويرها ، واستبدلها بالوسط المعاد تعليقه جيدا المعد في الخطوة 4.2.1. قم بتضمين بئر مع استبدال وسط التمايز بوسط التمايز فقط كعنصر تحكم سلبي ، حيث قد يؤدي المرطبات المتوسطة إلى بعض التورم العضوي. بعد ما يصل إلى 4 ساعات ، انتهى فحص التورم. تحليل النتائج.ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوات باستخدام مجهر EVOS M7000 الذي يسمح بالتصوير الآلي بفاصل زمني ساطع. للحصول على هذا المجهر ، راجع دليل الشركة المصنعة التفصيلي لإعداد تصوير الفاصل الزمني. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام أي مجهر آخر له خصائص مماثلة. لتحديد التورم العضوي ، قم بقياس قطر كل عضو فردي عند 0 ساعة و 4 ساعات. افتح صور قطرة عضوية واحدة عند 0 h و 4 h في ImageJ. انقر على أيقونة الخط المستقيم في شريط الأدوات ، وارسم أولا قطر العضو العضوي عند 0 ساعة. بعد ذلك ، استخدم أداة القياس في ImageJ (تحليل > قياس) لقياس طول هذا الخط ، وبالتالي قطر العضو قبل التورم. كرر العملية على نفس العضو العضوي في 4 ساعات للحصول على قطر العضو بعد التورم. قم بقياس القطر العضوي ل ~ 20 عضويا لكل حالة قبل وبعد فحص التورم. 5. بناء البلازميد لضرب Pax6 تصميم gRNA للضربة القاضية Pax6 باستخدام برامج تحرير قاعدة C > Tملاحظة: هناك الكثير من البرامج المتاحة لتصميم gRNA. هنا ، تم استخدام Benchling لأن هذا يسمح بتصميم gRNA المتكامل والتعليق التوضيحي ومحاذاة آثار Sanger. وبالتالي ، يمكن أيضا تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة باستخدام برامج بديلة.ابدأ عملية تصميم gRNA عن طريق تصور الجين المستهدف في Benchling بالنقر فوق جديد (+) > تسلسل الحمض النووي > استيراد تسلسلات الحمض النووي. في علامة التبويب استيراد من قاعدة البيانات ، اكتب الجين محل الاهتمام ، Pax6 ، واضغط على بحث. حدد أحدث إصدار من الجينوم المرجعي للماوس GRCm38 (mm10 ، Mus musculus) ، واضغط على استيراد. حدد exon حيث يمكن تصميم gRNA بالضربة القاضية من خلال الالتزام بالقواعد التالية:تجنب وضع gRNA في إكسون الترميز الأول ، لأن مواقع البدء البديلة في الإكسونات اللاحقة قد تستخدمها الخلية للتحايل على كودون التوقف المستحث المبكر. صمم gRNAs في exons الموجودة في جميع النصوص البديلة التي يمكن أن تحدث عن طريق ربط Pax6 mRNA. لضمان ذلك ، تصور Pax6 في متصفح جينوم Ensembl ، وحدد exon المستخدم في جميع النصوص. لمزيد من التحايل على الربط البديل ، استهدف إكسون يحتوي على كودون غير مكتمل (قاعدة أو قاعدتان متبقيتان من ثلاثة توائم). هذا أقل أهمية ولكنه يعطي مزيدا من اليقين حول تأثيرات indels المستحثة. بالنسبة إلى Pax6 ، يعد exon 4 إلى exon 11 هدفا جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، اختر إكسون يحتوي على بقايا التربتوفان (W) أو الجلوتامين (Q) أو الأرجينين (R).ملاحظة: تحتوي برامج تحرير قاعدة C > T القياسية التي تستخدم SpCas9 على نافذة تحرير تمتد من النوكليوتيدات 4 إلى النوكليوتيدات 8 من بداية gRNA (الأبعد عن PAM). يمكن لمحرري قاعدة C > T إدخال كودونات التوقف على جميع بقايا التربتوفان (W) (TGG إلى TGA أو TAG أو TAA) مع gRNA على الشريط العكسي ، وعلى بقايا الجلوتامين (Q) (CAG إلى TAG أو CAA إلى TAA) ، وأخيرا ، على بقايا الأرجينين (R) (CGA إلى TGA) على الشريط الأمامي. حدد exon + 20 قاعدة المنبع والمصب. انقر على الجانب الأيمن من الشاشة على علامة الهدف كريسبر ، وانقر على أدلة التصميم والتحليل. في القائمة المفتوحة حديثا ، ضمن علامة التبويب نوع التصميم ، حدد أدلة “التحرير الأساسي” (Komor et al. ، 2016). حافظ على طول الدليل عند 20 نيوكليوتيد ، وتحت جينوم الماوس ، حدد GRCm38 (mm10 ، Mus musculus). بعد النقر فوق علامة + الخضراء ، سيكتشف البرنامج تلقائيا جميع تسلسلات الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) ، وعلى الجانب الأيمن من الشاشة ، يقوم بإنشاء قائمة بجميع gRNAs المحتملة في المنطقة المحيطة ب exon محل الاهتمام. قم بالتمرير خلال القائمة حتى علامة كودون التوقف (*) في مربع أحمر ، والتي تشير إلى gRNA الذي يمكن أن يحول الحمض الأميني إلى كودون توقف ، وبالتالي يؤدي إلى خروج قاضي. في العمود الأول على يمين تسلسل gRNA ، لكل هدف “C” حول نافذة التحرير ، يتم حساب كفاءات التحرير المتوقعة في السيليكو . تأكد من أن تحرير C > T الذي ينتج عنه كودون التوقف لديه كفاءة تحرير لا تقل عن ~ 10. انقر فوق القيمة الموجودة في عمود خارج الهدف للتحقق من المواقع خارج الهدف التي يمكن أن يرتبط بها gRNA. تجنب اختيار gRNA الذي يرتبط بأي جينات إضافية لزيادة النوعية. على سبيل المثال ، يستهدف gRNA الجيد لتحرير Pax6 باستخدام محرر قاعدة C > T exon 7 وهو 5′-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3′. قم بإنشاء تعليق توضيحي في ملف Benchling بالنقر فوق رمز التعليقات التوضيحية في أعلى يمين الشاشة ، متبوعا بتعليق توضيحي جديد. قم بتسمية التعليق التوضيحي ، وتأكد من تحديد اتجاه gRNA الصحيح في القائمة المنسدلة Strand . جيل البلازميد gRNAملاحظة: هناك العديد من النواقل المتاحة لتوصيل gRNA إلى المواد العضوية. تم استخدام البلازميد التالي كقاعدة لبناء gRNA: pFYF1320 (Addgene # 47511 ، هدية لطيفة من كيث جونغ).لاستنساخ gRNAs في pFYF1320 ، قم بتنفيذ إستراتيجية PCR معكوسة باستخدام التمهيدي الأمامي القياسي: “/ 5phos / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. لتصميم التمهيدي العكسي ، الصق المكمل العكسي لتسلسل فاصل gRNA (تحقق مرة أخرى من اتجاه gRNA [+ أو – حبلا]) أمام جزء التمهيدي العكسي العالمي التالي: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. لاستهداف exon 7 من الماوس Pax6 باستخدام محرر قاعدة C > T ، يكون التمهيدي العكسي كما يلي: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. طلب كل من الاشعال. قم بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي باستخدام 1 نانوغرام من pFYF1320 كقالب باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة لمدة 35 دورة عند درجة حرارة تلدين تبلغ 61 درجة مئوية. قم بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أغاروز 1٪ في المخزن المؤقت TAE عند 100 فولت لمدة ~ 45 دقيقة لتصور الجزء المتوقع من 2281 زوجا أساسيا (bp). قم بإجراء تنظيف جل باستخدام المجموعة المفضلة. قم بإعداد تفاعل الربط التالي: 100 نانوغرام من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيف ، وإنزيم Dpn1 لإزالة الحمض النووي الأولي لقالب pFYF1320 ، و T4 ligase. احتضان المزيج لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية ، و 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، و 20 دقيقة عند 80 درجة مئوية. قم بتحويل مزيج التفاعل إلى بكتيريا DH5α المختصة كيميائيا ، وانشر البكتيريا على ألواح أجار تحتوي على الأمبيسلين15. في اليوم التالي ، اختر وقم بتوسيع ثلاث مستعمرات فردية في 3 مل من وسط مرق الليزوجيني (LB) المكمل ب 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. في اليوم التالي ، قم بإجراء miniprep على 1 مل من كل من الثقافات الصغيرة الثلاث باستخدام مجموعة miniprep ، وقم بتخزين الباقي في درجة حرارة 4 درجات مئوية. إخضاع البلازميد الذي تم الحصول عليه لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي U6_Forward لضمان إدخال gRNA بشكل صحيح في المتجه16. بعد تحديد مستعمرة بكتيرية واحدة مع البلازميد الصحيح ، قم بتلقيح 500 ميكرولتر من الثقافة المصغرة المقابلة في 50 مل من LB المكمل بالأمبيسلين لتضخيم الحمض النووي للبلازميد بين عشية وضحاها. قم بإجراء إعداد ميدي في اليوم التالي لاستخدام مجموعة midiprep. سيتم استخدام هذا البلازميد للتثقيب الكهربائي في القسم 6. 6. جيل من استنساخ Pax6 KO التثقيب الكهربائي العضويابدأ بعضويات الماوس التي تم تقسيمها قبل 5 أيام على الأكثر حتى تكون في حالة تكاثري. استخدم ~ 300-400 ميكرولتر من قطرات الأعضاء لكل ضربة قاضية. قم بتضمين شرط إضافي لاختيار عنصر تحكم سلبي سيتم كهربه بدون أي بلازميد. نفذ الخطوات 2.1-2.4 لفصل الكائنات العضوية ، ولكن افصل الكائنات العضوية لفترة أطول بحيث تكون خلايا مفردة. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي. في أنبوب سعة 1.5 مل ، قم بإعداد البلازميدات التالية بحد أقصى 20 ميكرولتر: 2.5 ميكروغرام من بلازميد pFYF1320-gRNA ، 2.8 ميكروغرام من البلازميد المحتوي على الترانسبوزاز ، 7.2 ميكروغرام من البلازميد المحتوي على الترانسبوزون المقاوم للهيجروميسين ، و 7.5 ميكروغرام من pCMV_ABEmax_P2A_GFP.ملاحظة: يقوم بلازميد pFYF1320-gRNA بتشفير gRNA المصمم مسبقا ، والذي يوجه المحرر الأساسي إلى الموضع المستهدف. يقوم pCMV_ABEmax_P2A_GFP البلازميد بتشفير المحرر الأساسي ، بالإضافة إلى مراسل GFP ، والذي يمكن استخدامه لمراقبة الخلايا التي تعبر عن المحرر الأساسي بعد التثقيب الكهربائي. يشفر البلازميد المحتوي على الترانسبوزاز الترانسبوزاز ، الذي يلصق الكاسيت المقاوم للرطوبة الذي توفره مقاومة الترانسبوزون المحتوي على الترانسبوزون في مكان ما بشكل عشوائي في الجينوم. تصبح الخلايا التي أدرجت هذا الكاسيت في جينومها مقاومة للهيجروميسين ويمكن اختيارها بشكل إيجابي عن طريق إضافة الهيجروميسين. نظرا لأن الدمج المشترك للعديد من البلازميدات أمر محتمل للغاية ، فإن مقاومة الهيجروميسين تشكل اختيارا وظيفيا لإثراء الخلايا التي تم تحريرها ل Pax6. أضف البلازميدات إلى الخلايا ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. قم بإعداد جهاز الحفر الكهربائي باستخدام المعلمات التالية لنبض المسام (الجهد: 175 فولت ؛ طول النبض: 5 مللي ثانية ؛ الفاصل الزمني للنبض: 50 مللي ثانية ؛ عدد النبضات: 2 ؛ معدل الاضمحلال: 10٪ ؛ القطبية: +) ولنقل النبض (الجهد: 20 فولت ؛ طول النبض: 50 مللي ثانية ؛ فاصل النبض: 50 مللي ثانية ؛ عدد النبضات: 5 ؛ معدل الاضمحلال: 40٪ ؛ القطبية: +/-). ضع الخلايا مع البلازميدات في كوفيت التثقيب الكهربائي. قم على الفور بقياس المقاومة (Ω) ، والتي يجب أن تكون بين 0.30 A و 0.55 A ، والكهرباء على الفور. يلزم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب استقرار الخلايا في الجزء السفلي من الكوفيت وتقليل كفاءة التثقيب الكهربائي. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وأضف 400 ميكرولتر من محلول التثقيب الكهربائي المكمل بمثبط رو كيناز. اسمح للخلايا بالتعافي في RT لمدة 30 دقيقة. قم بإذابة الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وقم بطلاء الخلايا في 200 ميكرولتر من ECM. بعد التصلب ، أضف وسيط توسيع الماوس. العضوية الكيسية تنمو بعد 2-3 أيام. راقب إشارة GFP ، التي تكشف عن وجود محرر قاعدة C > T ، يوميا. اختيار العضويةبعد ~ 3 أيام ، عندما تتعافى الكائنات العضوية ، أضف 100 ميكروغرام / مل من الهيجروميسين إلى وسط تمدد الماوس لتحديد المواد العضوية التي دمجت كاسيت مقاومة الهيجروميسين. هناك احتمال كبير أن الخلايا التي تمتص بلازميد واحد سوف تمتص عدة بلازميدات. من خلال اختيار المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين ، يتم إثراء الكائنات العضوية المحررة على موضع Pax6 . عندما تكون جميع الخلايا في السيطرة السلبية ميتة وتكون الكائنات العضوية الباقية ~ 300 ميكرومتر ، اختر الكائنات العضوية المقاومة للهيجروميسين. قطف الأعضاء والتنميط الجينيقم بإعداد أطراف P20 معقمة بجوار المجهر وأنابيب 1.5 مل تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول التربسين على الجليد. ثني طرف P20 بالملقط. راقب اللوحة التي تحتوي على المواد العضوية الباقية على مجهر منضدة. عندما يكون العضو العضوي الباقي على قيد الحياة في بؤرة التركيز ، قم بإزالة غطاء اللوحة. باستخدام طرف P20 المثني ولا يزال تحت المجهر ، قم بنضح كل عضو على قيد الحياة على حدة ، وضع كل منها في أنبوب منفصل يحتوي على محلول التربسين. التقاط ما يصل إلى 20 استنساخ. يعتمد عدد الحيوانات المستنسخة التي سيتم اختيارها على عدد الحيوانات المستنسخة المطلوبة لكل تصميم تجريبي وعلى كفاءة التحرير ، والتي تختلف باختلاف كل gRNA والموقع. عندما يتم التقاط جميع الحيوانات المستنسخة ، ضع أنابيب 1.5 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 دقائق. دوامة كل أنبوب بانتظام لزيادة سرعة التفكك ، والتحقق من المواد العضوية تحت المجهر فوق الطاولة. عندما يتم فصل الكائنات العضوية إلى كتل صغيرة و / أو خلايا مفردة ، أوقف عملية الهضم بإضافة 1 مل من الوسط الأساسي. لكل نسخة يتم اختيارها ، احتفظ ب ~ 400 ميكرولتر للنمط الجيني في أنبوب منفصل سعة 1.5 مل. قم بتدوير ~ 600 ميكرولتر اليسار عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 20 ميكرولتر من ECM ، وقم بوضعها كقطرة واحدة في بئر من صفيحة 24 بئرا ، وأضف وسيط تمدد الماوس بدون hygromycin. للتنميط الجيني للمستنسخات ، قم بتدوير الأنابيب التي تحتوي على ~ 400 ميكرولتر من تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي. احتضان الخلايا على الفور على النحو التالي: 6 دقائق عند 60 درجة مئوية ، دوامة ، و 4 دقائق عند 95 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بهذا الحمض النووي لمدة تصل إلى 7 أيام عند -20 درجة مئوية ، ولكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي على الفور هو الأمثل. لتضخيم الموضع المستهدف بالنيوكلياز ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج باستخدام بادئات التنميط الجيني المناسبة المطلوبة مسبقا وبوليميراز منخفض الدقة. بادئات التنميط الجيني هي AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) و TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). يجب أن يبدأ amplicon حوالي 100 نقطة أساس من الموضع المحرر المتوقع لضمان تسلسله بكفاءة. قم بتشغيل منتج PCR على هلام الأغاروز لتقييم كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو مذكور في الخطوة 5.2.3. عند اكتشاف شريط بالحجم الصحيح ، قم بقصه من الجل لإجراء استخراج هلام الحمض النووي باستخدام مجموعة. تسلسل الحمض النووي المستخرج من كل استنساخ عضوي تم اختياره مسبقا باستخدام بادئات التنميط الجيني. قم بمحاذاة التسلسلات التي تم الحصول عليها مع جين Pax6 في Benchling. افتح تسلسل الجينات المستوردة من الخطوة 4.1. انقر فوق المحاذاة على الجانب الأيمن ، ثم على إنشاء محاذاة جديدة. قم بتحميل ملفات .ab1 التي تم الحصول عليها من موفر التسلسل ، وحدد DNA كنوع نيوكليوتيد ، واضغط على التالي. في النافذة التالية ، حدد متعدد التسلسلات وبرنامج المحاذاة تلقائي (MAFFT) قبل النقر فوق إنشاء محاذاة. حدد الأنماط الجينية التي تحتوي على كودون توقف سابق لأوانه متماثل الزيجوت (كما تم الحصول عليه باستخدام محرري القاعدة) على كلا الأليلين. احتفظ بالنسخ المستنسخة العضوية المقابلة للتوسع ، واحفظها بالتبريد لمزيد من التحليل. من الناحية المثالية ، يجب تحليل ثلاثة استنساخ عضوي مختلف جنبا إلى جنب للتحايل على التأثيرات المحتملة للنيوكلياز خارج الهدف. 7. زرع تقويم العظام من عضويات الغدة الدمعية البشرية في الفئران NSG إعداد عضوييجب تقسيم عضويات الغدة الدمعية البشرية ~ 3 أيام قبل يوم الزرع ، كما هو موضح في القسم 2. في يوم الزرع ، تأكد من أن الكائنات العضوية في المرحلة التكاثرية لزيادة فرص النقش. لاستخراج المواد العضوية من ECM ، أضف dispase إلى وسط الاستزراع للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.125 وحدة / مل. باستخدام P1000 ، أعد تعليق قطرات ECM تماما لتعطيلها ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حجم 100 ميكرولتر من ECM يكفي لحقن ~ 10 غدد دمعية. أعد تعليق المواد العضوية في 10 مل من الوسط الأساسي لغسل الإنزيم. بيليه الخلايا في 400 × غرام لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا (~ 1,500,000) في 50 ميكرولتر من وسط التمدد البشري البارد المكمل ب 5٪ ECM. ضع التعليق العضوي على الجليد ، وانتقل فورا إلى عملية الزرع. زرع تقويم العظام في الفئرانفي منشأة الحيوانات ، لديك تعليق عضوي وإبر الأنسولين على الجليد. نضح تعليق عضوي في إبرة الأنسولين الباردة. قم بتخدير فأر NOD scid gamma (NSG) الذي يعاني من نقص المناعة مع 3٪ إيزوفلوران لبدء التخدير. عندما يكون الماوس نائما ، ضعه بسرعة على جانبه مع إمكانية الوصول إلى الغدة الدمعية الرئيسية (الموجودة في منتصف الطريق بين العين والأذن). حقن 5 ميكرولتر من المعلق العضوي مباشرة من خلال الجلد في الغدة الدمعية. الحد الأقصى للحجم الذي يمكن أن تحتويه الغدة الدمعية للفأر هو 5 ميكرولتر. اسمح للفأر بالتعافي ، ومراقبة الماوس كل يوم لتقييم وجود أي إزعاج يتعلق بعملية الزرع ، خاصة على العين. تقييم النقشالتضحية بالفأر باستنشاق O 2 / CO2 بعد ما يصل إلى 90 يوما اعتمادا على ما إذا كان يجب تقييم النقش قصير الأجل أو طويل الأجل13. تشريح الغدة الدمعية كما هو موضح في القسم 1. إصلاحه في 4 ٪ الفورمالين لمدة 24 ساعة في RT. ضع الغدة الدمعية في كاسيت. تجفيف الغدة الدمعية عن طريق حضنها على النحو التالي: 2 ساعة في 70٪ إيثانول ، 2 ساعة في 96٪ إيثانول ، 1 ساعة في 100٪ إيثانول (2x) ، 2 ساعة في الزيلين ، وبين عشية وضحاها في البارافين السائل عند 58 درجة مئوية في الفرن. في اليوم التالي ، قم بتوجيه الغدة الدمعية كما هو مفضل في قالب معدني ، وقم بتعبئتها بالبارافين السائل ، واترك الكتلة تتصلب على سطح بارد. من الأفضل تنفيذ هذه العملية باستخدام آلة التضمين. عندما تكون كتلة البارافين صلبة ، قم بتقطيع الكتلة بأكملها إلى أقسام 4-5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. احتفظ بجميع الأقسام (على شكل شرائط) في بيئة جافة وخالية من التيارات الهوائية. يمكن الاحتفاظ بالأقسام إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة. عينة واحدة من كل 10 أقسام تغطي الكتلة بأكملها.قم بتركيب الأقسام على شريحة على النحو التالي: ضع قطرة ماء على الشريحة ، ضع القسم في الأعلى ، واتركه يرتاح لمدة ~ 2 دقيقة للسماح له بالتمدد على لوح تسخين 42 درجة مئوية ، وقم بإزالة الماء برفق بالورق. ضع الشرائح لتجف طوال الليل في فرن على حرارة 58 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بالشرائح إلى أجل غير مسمى في RT بعد هذه المرحلة. لتمييز الخلايا البشرية عن خلايا الفأر ، قم بإجراء تلطيخ المستضد النووي البشري على هذه الأقسام. أعد ترطيب الأقسام عن طريق إجراء الغسلات التالية: 3 دقائق في الزيلين (2x) ، 1 دقيقة في 100٪ إيثانول (2x) ، 1 دقيقة لكل منهما 96٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 60٪ إيثانول ، و 25٪ إيثانول ، وأخيرا ، 1 دقيقة في ماء ديمي (2x). احتضان الشرائح لمدة 15 دقيقة في مخزن PO المؤقت (الجدول التكميلي 1). اغسل الشرائح 3x في ماء فائق النقاء. إجراء استرجاع مستضد قائم على السيترات في الأوتوكلاف:ضع الشرائح في حامل منزلق مقاوم للأوتوكلاف في سلة مملوءة بمخزن سترات مؤقت (الجدول التكميلي 1). ضع السلة في الأوتوكلاف ، وقم بتشغيل دورة الأوتوكلاف (الضغط: 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ درجة الحرارة: 121 درجة مئوية ؛ الوقت: 15 دقيقة). عندما يتم إزالة الضغط من الأوتوكلاف ، استرجع السلة التي تحتوي على الشرائح ، وضعها في حمام مائي RT لإحضار الشرائح إلى RT.ملاحظة: تعتمد استراتيجية استرجاع المستضد على الجسم المضاد المستخدم. ارجع إلى ورقة بيانات الموفر لإجراء استرجاع المستضد الأكثر ملاءمة. ضع الشرائح أفقيا ، بحيث يكون جانب القسم لأعلى ، على صينية حضانة. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في PBS في الأعلى ، واحتضانه لمدة 1 ساعة. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر. قم بإعداد محلول الجسم المضاد عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للمستضد النووي البشري إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل شريحة يتم تلوينها. أضف محلول الأجسام المضادة إلى كل شريحة. احتضان طوال الليل في صينية حضانة رطبة على حرارة 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني. احتضان الشرائح بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر HRP غير مخفف لمدة 45 دقيقة. اغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني.أنذر. في غطاء كيميائي ، قم بإعداد المخزن المؤقت DAB (الجدول التكميلي 1). احتضان الشرائح مع العازلة DAB لمدة 10 دقائق. تخلص من أي نفايات في حاويات النفايات السائلة الكيميائية العضوية. اغسل الشرائح بالماء. احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة في الهيماتوكسيلين لمقاومة النوى. اغسل الشرائح في ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق. قم بتجفيف الشرائح عن طريق احتضانها لمدة دقيقة واحدة في كل منها 50٪ إيثانول ، 60٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 1 دقيقة في 96٪ إيثانول (2x) ، 1 دقيقة في 100٪ إيثانول (2x) ، و 1 دقيقة في زيلين (2x). أرفق الشرائح بوسيط تثبيت وقسيمة غطاء. بعد التجفيف لمدة 20 دقيقة ، راقب الشرائح تحت المجهر.أنا>