Istituzione, mantenimento, differenziazione, manipolazione genetica e trapianto di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana

Gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato etico animale della Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) con licenza di progetto AVD8010020151. Gli organoidi sono stati derivati da materiale in eccesso di topo. Le biopsie della ghiandola lacrimal umana sono state raccolte dal materiale di scarto dei pazienti sottoposti a intervento chirurgico presso il Centro medico universitario di Utrecht (UMCU) dopo l’approvazione da parte del comitato etico medico sotto il numero di protocollo 18-740. Il protocollo contiene diverse sezioni descritte nella Figura 1. Figura 1: Panoramica del protocollo. Questa figura evidenzia le diverse fasi del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. NOTA: Tutte le composizioni del terreno e del tampone sono descritte nella tabella supplementare 1. 1. Costituzione di organoidi da topo e ghiandole lacrimali umane Sezionare la ghiandola lacrimale del topoPreparare gli strumenti di dissezione, tra cui forbici, pinze e cuscinetti di dissezione. Eutanasia di un topo mediante inalazione di O 2/CO2 13. Metti il topo eutanasia sul suo addome sul tampone di dissezione e blocca i suoi arti. Bagnare i capelli situati tra le orecchie del topo e sulla fronte usando il 70% di etanolo. Usando le forbici da dissezione, fai un’apertura dietro il cranio tra le orecchie. Estendi questa apertura sulla fronte fino al naso. Sempre usando le forbici, tagliare la pelle dietro le orecchie per generare due lembi. Tirare saldamente i lembi verso il naso fino a quando le ghiandole lacrimali sono esposte, come mostrato nella Figura 2A. Appuntare i lembi al tampone di dissezione. Usando le forbici, fare una piccola incisione nella membrana situata sopra la ghiandola lacrimale per esporre completamente la ghiandola lacrimale. Usando la pinza, tirare la ghiandola lacrimale. Ci dovrebbe essere una certa resistenza fino a quando il dotto lacrimale principale è strappato. Se si preferisce, tagliare il condotto lacrimale principale direttamente con le forbici. Posizionare la ghiandola lacrimale del topo in PBS di grado coltura tissutale fino a ulteriore elaborazione. Procedere con l’elaborazione della ghiandola lacrimale entro 2-4 ore per limitare la morte cellulare. Se questo richiede più tempo, posizionare la ghiandola lacrimale del topo nel mezzo di raccolta della biopsia (Tabella supplementare 1).NOTA: Diverse ghiandole lacrimali possono essere raggruppate se un gran numero di organoidi sono necessari immediatamente. Raccolta di biopsie della ghiandola lacrimale umanaPrima dell’intervento, preparare 20 ml di aliquote di mezzo di raccolta bioptica (Tabella supplementare 1) in una provetta da 50 mL e consegnarle al chirurgo prima dell’intervento. Questo mezzo può essere mantenuto a 4 °C per diversi mesi. Il giorno dell’intervento, lasciare che il chirurgo campioni un pezzo della ghiandola lacrimale (di solito <1 mm3) e lo conservi nel mezzo di raccolta della biopsia (Tabella supplementare 1) a 4 °C. Raccogliere la biopsia per elaborarlo il prima possibile. Idealmente, questo dovrebbe essere lo stesso giorno entro 2 ore dal prelievo bioptico. Derivazione organoidePreparare in anticipo: matrice extracellulare scongelata (ECM), topo a temperatura ambiente (RT) o mezzo di espansione umano (Tabella supplementare 1), collagenasi scongelata, terreno di base (Tabella supplementare 1), due bisturi, una capsula di Petri da 10 cm, un filtro da 70 μm montato su un tubo da 15 ml e piastre di sospensione a 12 pozzetti preriscaldate a 37 °C per 30 minuti. Preparare il mezzo di digestione combinando tutti i componenti mostrati nella tabella supplementare 1. Pre-bagnare i bisturi in questo mezzo per evitare che i pezzi di tessuto si attacchino a loro. Recuperare il topo o il tessuto della ghiandola lacrimale umana dal mezzo e posizionarlo nella capsula di Petri. Usando i bisturi pre-bagnati, tritare il tessuto. Una volta che i pezzi di tessuto sono molto piccoli (cioè <0,5 mm3), metterli nel mezzo di digestione raschiandoli dalla capsula di Petri con il bisturi. Se la biopsia umana è già molto piccola, posizionarla direttamente nel mezzo di digestione senza tritare per evitare la perdita di tessuto. Incubare i pezzi di tessuto per un massimo di 15 minuti a bagnomaria a 37 °C. Capovolgere regolarmente il tubo da 15 ml per risospendere i pezzi. Monitorare la dissociazione cellulare al microscopio da banco in modo da non digerire eccessivamente il tessuto. Nel frattempo, restringere una pipetta Pasteur mettendo la punta in una fiamma durante la rotazione e pre-bagnarla nel mezzo di base. Per dissociare efficacemente il tessuto, assicurarsi che il foro sia leggermente più piccolo dei pezzi di tessuto più grandi rimasti. Per facilitare il processo di dissociazione, pipettare la miscela su e giù ogni 5 minuti con la pipetta Pasteur ristretta pre-bagnata. Quando molte cellule singole e piccoli grumi sono visibili al microscopio, interrompere la dissociazione aggiungendo 10 ml del mezzo di base. Girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml del mezzo base per ripetere il lavaggio. Filtrarlo attraverso un colino da 70 μm per rimuovere i grandi pezzi di tessuto non digeriti e le restanti fibre di collagene, che impedirebbero un’adeguata polimerizzazione dell’ECM. Girare l’eluato a 400 x g per 5 minuti.NOTA: Un pellet di globuli rossi indica la presenza di globuli rossi, che normalmente non ostacola la derivazione organoide. Tuttavia, per alcune applicazioni, come la citometria a flusso, i globuli rossi dovrebbero essere lisati. Per questo, incubare le cellule in 5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi freschi a RT per 5 minuti e pellettare le cellule a 400 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 μL di ECM fredda per una singola ghiandola lacrimale di topo e in 50 μL di ECM fredda per una biopsia umana. Quando si risospende, fare attenzione a non creare bolle, poiché queste influenzerebbero anche la polimerizzazione e la stabilità dell’ECM. Seminare fino a 100 μL di cellule per pozzetto di una piastra di sospensione a 12 pozzetti. Utilizzare un P200 per produrre ~ 20 μL di goccioline nel pozzo. Più piccole sono le goccioline, migliore è la diffusione dei fattori di crescita e dei nutrienti attraverso la matrice. Posizionare la piastra capovolta in un incubatore umidificato a 37 °C per 20-30 minuti per consentire all’ECM di solidificarsi. Una volta che l’ECM è solidificato, aggiungere ~ 1 mL di mouse RT o mezzo di espansione umana per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Rinfrescare il terreno ogni 2-3 giorni fino a quando gli organoidi raggiungono una dimensione di 300 μm. Per questo, aspirare il mezzo nel pozzo e aggiungere delicatamente il mezzo di espansione sul lato del pozzetto senza toccare le goccioline ECM in modo da non interromperle.NOTA: Primocin (100 mg / ml; 1: 1.000 da stock commerciali) può essere aggiunto dopo l’isolamento se si verifica una contaminazione batterica. Tuttavia, poiché rallenta anche la crescita degli organoidi, è preferibile non aggiungerlo o rimuoverlo dopo uno o due passaggi. 2. Espansione degli organoidi del topo e della ghiandola lacrimale umana Dopo ~ 7 giorni per gli organoidi di topo e ~ 10 giorni per gli organoidi umani, quando gli organoidi raggiungono una dimensione di ~ 300 μm, rimuovere il terreno di coltura. Risospendere le goccioline di ECM contenenti gli organoidi in 1 mL di soluzione di tripsina pipettando vigorosamente su e giù con un P1.000 fino a quando le goccioline si sfaldano. Trasferire questa miscela in una provetta da 15 ml e incubarla brevemente a bagnomaria a 37 °C. Dopo 2-3 minuti, utilizzare una pipetta Pasteur ristretta e pre-bagnata per pipettare la sospensione organoide su e giù 10x-15x. Controllare lo stato di dissociazione degli organoidi al microscopio da banco; Dovrebbero essere ottenuti piccoli grumi di ~ 20 cellule. Incubare più a lungo nel bagnomaria a 37 °C e ripetere la fase di pipettaggio fino a quando la dissociazione è soddisfacente.NOTA: Questo passaggio potrebbe richiedere più tempo per gli organoidi umani in quanto sono multistrato. Verranno generate singole celle; Ciò non influisce sulla crescita organoide finché la maggior parte della sospensione organoide è costituita da piccoli grumi. Interrompere la dissociazione aggiungendo 10 ml del mezzo di base. Quindi, pellet le cellule a 400 x g per 5 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante e la MEC che possono trovarsi sopra gli organoidi (strato trasparente gelatinoso senza organoidi), risospendere le cellule in un volume appropriato di ECM fredda prima di placcare in una piastra di sospensione, come indicato al punto 1.3.10.NOTA: Generalmente, gli organoidi lacrimali di topo sono divisi in un rapporto 1: 5 e gli organoidi umani in un rapporto 1: 3. Ciò significa che, quando si inizia con organoidi contenuti in 100 μL di ECM, devono essere risospesi rispettivamente in 500 μL e 300 μL, dopo la scissione. Incubare la piastra capovolta in un incubatore a 37 °C fino alla solidificazione dell’ECM per 30 minuti e coprire gli organoidi con il topo o il mezzo di espansione umano a RT. 3. Crioconservazione degli organoidi del topo e della ghiandola lacrimale umana Per crioconservare gli organoidi, dividere prima gli organoidi nel mezzo di dilatazione secondo le istruzioni fornite nella sezione 2. Circa 3-4 giorni dopo, quando gli organoidi sono in una fase di crescita, rimuovere il terreno e risospendere 100 μL di organoidi contenenti ECM in 10 ml di terreno base freddo. Incubare su ghiaccio per 10 minuti per aiutare a dissociare l’ECM. Capovolgere regolarmente il tubo per facilitare questo processo. Pellettare gli organoidi a 500 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet organoide in 1 ml di terreno di crioconservazione (la ECM residua non compromette la crioconservazione). Trasferire la sospensione organoide in un crioviale e immediatamente in un congelatore a -80 °C.NOTA: Quando si utilizza il mezzo di crioconservazione descritto nella Tabella dei Materiali, i crioviali possono essere conservati indefinitamente in un congelatore a -80 °C. Se viene utilizzato un altro mezzo di crioconservazione, trasferire il crioviale in un serbatoio di azoto liquido dopo 24 ore per garantire una conservazione ottimale. Per scongelare gli organoidi, recuperare il crioviale dal congelatore e trasportarlo su ghiaccio secco a bagnomaria a 37 °C. Tenere il criovial in acqua fino a quando la maggior parte del suo contenuto non si è scongelato. Trasferire il contenuto in un tubo da 15 mL contenente 10 mL di terreno base e far ruotare le cellule a 400 x g per 5 minuti. Placcare gli organoidi in 100 μL di ECM con il mezzo di espansione, come descritto nei punti 2.5 e 2.6. 4. Differenziare gli organoidi delle ghiandole lacrimali e valutarne la funzionalità Differenziazione organoidePer differenziare gli organoidi della ghiandola lacrimale, dividere prima gli organoidi nel mezzo di espansione secondo le istruzioni riportate nella sezione 2. Dopo 2 giorni, sostituire il mezzo di espansione con il mouse o il mezzo di differenziazione umano come descritto al punto 1.3.12. Rinfrescare il terreno ogni 2-3 giorni per mantenere gli organoidi di topo per 5 giorni in quel mezzo e gli organoidi umani per 9 giorni. Per valutare la differenziazione degli organoidi dopo 5 giorni o 9 giorni nel mezzo di differenziazione, raccogliere 100 μL di organoidi contenenti ECM per estrarre l’RNA. Per fare ciò, risospendere le goccioline di ECM in 1 ml di terreno contenuto nel pozzetto utilizzando un P1.000 e trasferire la sospensione organoide in 3 ml di terreno base ghiacciato. Pellettare gli organoidi a 500 x g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel tampone di estrazione dell’RNA. Eseguire l’estrazione dell’RNA a valle secondo le istruzioni del kit di estrazione dell’RNA. Utilizzare l’RNA ottenuto, ad esempio, per l’analisi RT-qPCR dell’espressione di cellule staminali (TP63, KRT5, KRT14) e marcatori cellulari differenziati (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2…) 14.NOTA: Per ottenere l’analisi di espressione pertinente, misurare l’espressione dei marcatori scelti in uno o più campioni di tessuto. Gli organoidi coltivati in condizioni di differenziazione tendono a contenere meno RNA. Saggio di gonfiore funzionaleNOTA: Per questa parte del protocollo, utilizzare organoidi della ghiandola lacrimale umana che sono stati differenziati per almeno 7 giorni. Il tempo minimo richiesto è di 7 giorni per garantire un’espressione sufficiente del marcatore per lo strappo funzionale. Ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti costituisce una condizione. Il numero minimo di condizioni è tre: un controllo positivo, un controllo negativo e una condizione di test.Preparare appena 1 mL di terreno di differenziazione umana contenente singoli componenti che inducono la secrezione da parte degli organoidi della ghiandola lacrimale. Ad esempio, aggiungere 100 μM di noradrenalina e 1 μM di forskolina e mescolare accuratamente.NOTA: Forskolin serve come un controllo positivo che di solito induce il massimo gonfiore. In un microscopio time-lapse a campo chiaro automatizzato, impostare le posizioni da visualizzare nella lastra, l’intervallo di tempo (5 minuti) e la durata (4 ore). Assicurarsi che un’intera goccia ECM sia visibile in ogni posizione. Subito prima di iniziare a visualizzare e senza spostare la lastra dal microscopio, rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti che verranno ripresi e sostituirlo con il mezzo ben risospeso preparato al punto 4.2.1. Includere come controllo negativo un pozzo con mezzo di differenziazione sostituito dal solo mezzo di differenziazione, poiché il ristoro medio può innescare un certo gonfiore organoide. Dopo un massimo di 4 ore, il test di gonfiore è finito. Analizza i risultati.NOTA: Questi passaggi vengono eseguiti con un microscopio EVOS M7000 che consente l’imaging time-lapse in campo chiaro automatizzato. Per quel microscopio, fare riferimento al manuale dettagliato del produttore per impostare l’imaging time-lapse. Da notare, qualsiasi altro microscopio con caratteristiche simili può essere utilizzato. Per quantificare il gonfiore organoide, misurare il diametro di ogni singolo organoide a 0 h e 4 h. Apri le immagini di una singola goccia organoide a 0 h e 4 h in ImageJ. Fai clic sull’icona Retta nella barra degli strumenti e disegna prima il diametro di un organoide a 0 h. Quindi, utilizzare lo strumento Misura in ImageJ (Analizza > misura) per misurare la lunghezza di questa linea e, quindi, il diametro dell’organoide prima del gonfiore. Ripetere il processo sullo stesso organoide a 4 h per ottenere il diametro organoide dopo il gonfiore. Misurare il diametro organoide di ~ 20 organoidi per condizione prima e dopo il test di gonfiore. 5. Costruire un plasmide per mettere fuori combattimento Pax6 Progettazione di gRNA per knockout Pax6 utilizzando editor di base C > TNOTA: Ci sono molti programmi software disponibili per la progettazione di gRNA. Qui, Benchling è stato utilizzato in quanto consente la progettazione integrata del gRNA, l’annotazione e l’allineamento delle tracce di Sanger. Tutti i passaggi successivi possono, quindi, essere eseguiti anche utilizzando programmi software alternativi.Avviare il processo di progettazione del gRNA visualizzando il gene bersaglio in Benchling facendo clic su Nuovo (+) > Sequenza di DNA > Importa sequenze di DNA. Nella scheda Importa da database, digitare il gene di interesse, Pax6, e premere Cerca. Selezionare la build più recente del genoma di riferimento del mouse GRCm38 (mm10, Mus musculus) e premere Importa. Selezionare l’esone in cui il gRNA knock-out può essere progettato aderendo alle seguenti regole:Evitare di mettere un gRNA nel primo esone codificante, perché siti di inizio alternativi negli esoni successivi possono essere utilizzati dalla cellula per aggirare il codone di stop indotto precocemente. Progettare gRNA negli esoni che sono presenti in tutti i trascritti alternativi che possono avvenire mediante splicing dell’mRNA Pax6 . Per garantire ciò, visualizzare Pax6 nel browser del genoma di Ensembl e selezionare l’esone utilizzato in tutte le trascrizioni. Per aggirare ulteriormente lo splicing alternativo, colpire un esone che ha un codone incompleto (una o due basi rimanenti di una tripla). Questo è di minore importanza, ma dà maggiore certezza sugli effetti degli indels indotti. Per Pax6, l’esone da 4 a 11 è un buon bersaglio. Inoltre, scegliere un esone che contiene residui di triptofano (W), glutammina (Q) o arginina (R).NOTA: Gli editor di base standard C > T che utilizzano SpCas9 hanno una finestra di modifica che si estende dal nucleotide 4 al nucleotide 8 dall’inizio del gRNA (più lontano dal PAM). Gli editor di basi C > T possono introdurre codoni di stop su tutti i residui di triptofano (W) (da TGG a TGA, TAG o TAA) con un gRNA sul filamento inverso, sui residui di glutammina (Q) (CAG a TAG o CAA a TAA) e, infine, sui residui di arginina (R) (da CGA a TGA) sul filamento anteriore. Seleziona l’esone + 20 basi a monte e a valle. Fai clic sul lato destro dello schermo sul segno di destinazione CRISPR e fai clic su Progetta e analizza guide. Nel menu appena aperto, sotto la scheda Tipo di progettazione, spuntare le Guide per “editing di base” (Komor et al., 2016). Mantenere la lunghezza guida a 20 nucleotidi e, sotto Genoma per topo, selezionare GRCm38 (mm10, Mus musculus). Dopo aver fatto clic sul segno + verde, il programma software rileverà automaticamente tutte le sequenze di protospaziatori adiacenti (PAM) e, sul lato destro dello schermo, creerà un elenco di tutti i potenziali gRNA nell’area intorno all’esone di interesse. Scorri l’elenco fino al segno del codone di stop (*) in una casella rossa, che segnala un gRNA che può potenzialmente trasformare un amminoacido in un codone di stop e, quindi, provocare un knock-out. Nella prima colonna a destra della sequenza di gRNA, per ogni target “C” attorno alla finestra di editing, vengono calcolate le efficienze di editing previste in silico . Assicurarsi che la modifica C > T che si traduce nel codone di arresto abbia un’efficienza di modifica di almeno ~ 10. Fare clic sul valore nella colonna Off-Target per verificare a quali loci off-target il gRNA potrebbe legarsi. Evitare di scegliere un gRNA che si lega a qualsiasi geni aggiuntivo per aumentare la specificità. Ad esempio, un buon gRNA per modificare Pax6 con un editor di base C > T mira all’esone 7 ed è 5′-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3′. Crea un’annotazione nel file Benchling facendo clic sull’icona Annotazioni in alto a destra dello schermo, seguita da Nuova annotazione. Assegna un nome all’annotazione e assicurati che nel menu a discesa Strand sia selezionato l’orientamento corretto del gRNA. generazione di plasmidi gRNANOTA: Ci sono vari vettori disponibili per la consegna del gRNA negli organoidi. Il seguente plasmide è stato usato come base per la costruzione del gRNA: pFYF1320 (Addgene #47511, un gentile regalo di Keith Joung).Per clonare i gRNA in pFYF1320, implementare una strategia di PCR inversa utilizzando il primer standard in avanti: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Per progettare il primer inverso, incollare il complemento inverso della sequenza distanziatrice di gRNA (ricontrollare l’orientamento del gRNA [+ o – filamento]) davanti alla seguente parte universale di primer inverso: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Per indirizzare l’esone 7 del topo Pax6 usando l’editor di base C > T, il primer inverso è il seguente: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCCCTCCACAAG. Ordina entrambi i primer. Eseguire una reazione di PCR inversa utilizzando 1 ng di pFYF1320 come modello utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedeltà per 35 cicli a una temperatura di ricottura di 61 °C. Eseguire la reazione PCR su un gel di agarosio all’1% in tampone TAE a 100 V per ~ 45 minuti per visualizzare il frammento atteso di 2.281 coppie di basi (bp). Eseguire una pulizia del gel utilizzando il kit preferito. Impostare la seguente reazione di legatura: 100 ng di prodotto PCR ripulito, enzima Dpn1 per rimuovere il DNA modello iniziale pFYF1320 e T4 ligasi. Incubare la miscela per 15 min a 20 °C, 30 min a 37 °C e 20 min a 80 °C. Trasformare la miscela di reazione in batteri DH5α chimicamente competenti e diffondere i batteri su piastre di agar contenenti ampicillina15. Il giorno successivo, raccogliere ed espandere tre singole colonie in 3 ml di terreno di brodo lisogenico (LB) integrato con 50 μg / mL di ampicillina. Il giorno dopo, eseguire un miniprep su 1 mL di ciascuna delle tre mini-colture utilizzando un kit miniprep e conservare il resto a 4 °C. Sottoporre il plasmide ottenuto al sequenziamento Sanger con il primer U6_Forward per garantire che il gRNA sia inserito correttamente nel vettore16. Dopo aver identificato una singola colonia batterica con il plasmide corretto, inoculare 500 μL della corrispondente mini-coltura in 50 ml di LB integrata con ampicillina per amplificare il DNA plasmidico durante la notte. Eseguire una midi-prep il giorno dopo aver utilizzato un kit midiprep. Questo plasmide sarà utilizzato per l’elettroporazione nella sezione 6. 6. Generazione di cloni di Pax6 KO Elettroporazione organoideInizia con organoidi di topo che sono stati divisi al massimo 5 giorni prima in modo che siano in uno stato proliferativo. Utilizzare ~ 300-400 μL di goccioline organoidi per knock-out. Includere una condizione aggiuntiva per la selezione di un controllo negativo che verrà elettropolato senza alcun plasmide. Eseguire i passaggi 2.1-2.4 per dissociare gli organoidi, ma dissociare gli organoidi più a lungo in modo che siano singole cellule. Scartare il surnatante. Risospendere le celle in 80 μL del tampone di elettroporazione. In una provetta da 1,5 ml, preparare i seguenti plasmidi per un massimo di 20 μL: 2,5 μg di plasmide pFYF1320-gRNA, 2,8 μg di plasmide contenente transposasi, 7,2 μg di plasmide contenente trasposoni di resistenza all’igromicina e 7,5 μg di pCMV_ABEmax_P2A_GFP.NOTA: Il plasmide pFYF1320-gRNA codifica il gRNA precedentemente progettato, che guida l’editor di base verso il locus target. Il plasmide pCMV_ABEmax_P2A_GFP codifica l’editor di base, così come un reporter GFP, che può essere utilizzato per monitorare le cellule che esprimono l’editor di base dopo l’elettroporazione. Il plasmide contenente la trasposasi codifica per la trasposasi, che incolla la cassetta di resistenza all’igromicena fornita dal plasmide contenente trasposoni di resistenza all’igromina da qualche parte casualmente nel genoma. Le cellule che hanno incorporato questa cassetta nel loro genoma diventano resistenti all’igromicina e possono essere selezionate positivamente con l’aggiunta di igromicina. Poiché la co-incorporazione di diversi plasmidi è molto probabile, la resistenza all’igromicina costituisce una selezione funzionale da arricchire per le cellule che sono state modificate per Pax6. Aggiungere i plasmidi alle cellule e mescolare bene pipettando su e giù. Impostare l’elettroporatore con i seguenti parametri per l’impulso di poring (tensione: 175 V; lunghezza dell’impulso: 5 ms; intervallo di impulso: 50 ms; numero di impulsi: 2; tasso di decadimento: 10%; polarità: +) e per l’impulso di trasferimento (tensione: 20 V; lunghezza dell’impulso: 50 ms; intervallo di impulso: 50 ms; numero di impulsi: 5; tasso di decadimento: 40%; polarità: +/-). Posizionare le cellule con i plasmidi in una cuvetta di elettroporazione. Misurare immediatamente la resistenza (Ω), che dovrebbe essere compresa tra 0,30 A e 0,55 A, ed elettropolare immediatamente. È necessario eseguire rapidamente questo passaggio per evitare che le celle si depositino sul fondo della cuvetta e ridurre l’efficienza dell’elettroporazione. Trasferire le cellule in un tubo da 1,5 ml e aggiungere 400 μL di tampone di elettroporazione integrato con un inibitore della Rho-chinasi. Lasciare che le cellule si riprendano a RT per 30 minuti. Pellettare le cellule a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e placcare le cellule in 200 μL di ECM. Dopo la solidificazione, aggiungere il mezzo di espansione del mouse. Gli organoidi cistici crescono dopo 2-3 giorni. Monitorare quotidianamente il segnale GFP, che rivela la presenza dell’editor di base C > T. Selezione degli organoidiDopo ~ 3 giorni, quando gli organoidi si sono ripresi, aggiungere 100 μg / mL di igromicina al mezzo di espansione del topo per selezionare gli organoidi che hanno integrato la cassetta di resistenza all’igromicina. C’è un’alta probabilità che le cellule che assorbono un plasmide occupino diversi plasmidi. Selezionando organoidi resistenti all’igromicina, gli organoidi modificati sul locus Pax6 vengono arricchiti. Quando tutte le cellule nel controllo negativo sono morte e gli organoidi sopravvissuti sono ~ 300 μm, scegli gli organoidi resistenti all’igromicina. Raccolta e genotipizzazione degli organoidiPreparare punte sterili P20 accanto al microscopio e provette da 1,5 ml contenenti 100 μL di soluzione di tripsina ciascuna su ghiaccio. Piegare una punta P20 con una pinza. Osservare la piastra contenente gli organoidi sopravvissuti su un microscopio da banco. Quando un organoide sopravvissuto è a fuoco, rimuovere il coperchio del piatto. Utilizzando la punta piegata P20 e ancora al microscopio, aspirare ciascun organoide sopravvissuto individualmente e posizionare ciascuno di questi in una provetta separata contenente soluzione di tripsina. Raccogli fino a 20 cloni. Il numero di cloni da scegliere dipende dal numero di cloni richiesti per ogni disegno sperimentale e dall’efficienza di editing, che varia a seconda di ogni gRNA e locus. Quando tutti i cloni sono stati raccolti, posizionare i tubi da 1,5 ml in un bagnomaria a 37 °C per un massimo di 5 minuti. Vortice ogni tubo regolarmente per aumentare la velocità di dissociazione e controllare gli organoidi sotto il microscopio da banco. Quando gli organoidi sono dissociati in piccoli grumi e / o singole cellule, interrompere la digestione aggiungendo 1 ml di terreno base. Per ogni clone scelto, mantenere ~400 μL per genotipo in una provetta separata da 1,5 ml. Ruotare i ~ 600 μL rimasti a 500 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 20 μL di ECM, placcarle come una singola goccia in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere il mezzo di espansione del mouse senza igromina. Per genotipizzare i cloni, ruotare i tubi contenenti ~ 400 μL di sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 50 μL di tampone di estrazione del DNA per estrarre il DNA. Incubare immediatamente le cellule come segue: 6 min a 60 °C, vortice e 4 min a 95 °C. Questo DNA può essere conservato fino a 7 giorni a -20 °C, ma l’esecuzione immediata della PCR a valle è ottimale. Per amplificare il locus mirato con la nucleasi, eseguire una PCR su 2 μL del DNA estratto utilizzando adeguati primer di genotipizzazione ordinati in precedenza e una polimerasi a bassa fedeltà. I primer di genotipizzazione sono AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) e TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). L’amplicone dovrebbe iniziare a circa 100 bp dal locus modificato previsto per assicurarsi che sia sequenziato in modo efficiente. Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio per valutare l’efficienza della PCR, come indicato al punto 5.2.3. Quando viene rilevata una fascia della dimensione corretta, tagliarla dal gel per eseguire un’estrazione del gel di DNA utilizzando un kit. Sequenziare il DNA estratto da ciascun clone organoide precedentemente prelevato con i primer di genotipizzazione. Allineare le sequenze ottenute al gene Pax6 in Benchling. Aprire la sequenza genica importata dal punto 4.1. Fare clic su Allineamenti sul lato destro, quindi su Crea nuovo allineamento. Caricare i file .ab1 ottenuti dal provider di sequenziamento, selezionare DNA come tipo di nucleotide e premere Avanti. Nella finestra seguente, selezionare Multisequenza e il programma di allineamento Auto (MAFFT) prima di fare clic su Crea allineamento. Identificare i genotipi che hanno un codone di stop prematuro omozigote (come ottenuto con gli editor di base) su entrambi gli alleli. Mantenere i cloni organoidi corrispondenti per espanderli e crioconservarli per ulteriori analisi. Idealmente, tre diversi cloni di organoidi dovrebbero essere analizzati fianco a fianco per aggirare potenziali effetti off-target della nucleasi. 7. Trapianto ortotopico di organoidi della ghiandola lacrimale umana in topi NSG Preparazione organoideGli organoidi della ghiandola lacrimale umana devono essere divisi ~3 giorni prima del giorno del trapianto, come descritto nel paragrafo 2. Il giorno del trapianto, assicurarsi che gli organoidi siano in fase proliferativa per aumentare le possibilità di attecchimento. Per estrarre gli organoidi dalla ECM, aggiungere dispase al terreno di coltura per raggiungere una concentrazione finale di 0,125 U/mL. Utilizzando un P1.000, risospendere accuratamente le goccioline ECM per interromperle e riposizionare la piastra nell’incubatore a 37 °C per 30 minuti. Un volume di 100 μL di ECM è sufficiente per iniettare ~ 10 ghiandole lacrimali. Risospendere gli organoidi in 10 ml di terreno base per lavare l’enzima. Pellettare le celle a 400 x g per 5 min. Risospendere le cellule (~1.500.000) in 50 μL di mezzo di espansione umano freddo integrato con ECM al 5%. Posizionare la sospensione organoide sul ghiaccio e procedere immediatamente al trapianto. Trapianto ortotopico nei topiNella struttura per animali, avere la sospensione organoide e gli aghi di insulina sul ghiaccio. Aspirare la sospensione organoide in un ago da insulina freddo. Sedare un topo immunodeficiente NOD scid gamma (NSG) con isoflurano al 3% per iniziare l’anestesia. Quando il topo dorme, posizionalo rapidamente su un fianco con la ghiandola lacrimale principale (situata a metà strada tra l’occhio e l’orecchio) accessibile. Iniettare 5 μL della sospensione organoide direttamente attraverso la pelle nella ghiandola lacrimale. Il volume massimo che una ghiandola lacrimale di topo può contenere è di 5 μL. Lasciare che il topo si riprenda e monitorare il topo ogni giorno per valutare la presenza di eventuali fastidi legati al trapianto, soprattutto sull’occhio. Valutare l’attecchimentoSacrificare il topo con l’inalazione di O 2/CO2 dopo un massimo di 90 giorni a seconda che debba essere valutato l’attecchimento a breve o lungo termine13. Sezionare la ghiandola lacrimale come descritto nel paragrafo 1. Fissalo in formalina al 4% per 24 ore a RT. Mettere la ghiandola lacrimale in una cassetta. Disidratare la ghiandola lacrimale incubandola come segue: 2 h in etanolo al 70%, 2 ore in etanolo al 96%, 1 ora in etanolo al 100% (2x), 2 ore in xilene e pernottamento in paraffina liquida a 58 °C in forno. Il giorno dopo, orientare la ghiandola lacrimale come preferito in uno stampo metallico, rabboccarla con paraffina liquida e lasciare che il blocco si solidifichi su una superficie fredda. Questo processo viene eseguito al meglio con una macchina di incorporamento. Quando il blocco di paraffina è solido, tagliare l’intero blocco in sezioni di 4-5 μm usando un microtomo. Conservare tutte le sezioni (a forma di nastri) in un ambiente asciutto e privo di correnti d’aria. Le sezioni possono essere conservate indefinitamente a temperatura ambiente. Campiona una sezione su 10 che copre l’intero blocco.Montare le sezioni su un vetrino come segue: mettere una goccia d’acqua sul vetrino, posizionare la sezione sopra, lasciarla riposare per ~ 2 minuti per consentirgli di allungarsi su una piastra calda a 42 ° C e rimuovere delicatamente l’acqua con carta. Mettere i vetrini ad asciugare per una notte in forno a 58 °C. Le diapositive possono essere conservate indefinitamente a RT oltre questa fase. Per distinguere le cellule umane dalle cellule di topo, eseguire la colorazione dell’antigene nucleare umano su queste sezioni. Reidratare le sezioni eseguendo i seguenti lavaggi: 3 min in xilene (2x), 1 min in etanolo al 100% (2x), 1 min ciascuno in etanolo al 96%, etanolo al 90%, etanolo all’80%, etanolo al 70%, etanolo al 60% e etanolo al 25% e, infine, 1 min in acqua demi (2x). Incubare i vetrini per 15 minuti nel buffer PO (Tabella supplementare 1). Lavare i vetrini 3 volte in acqua ultrapura. Eseguire un prelievo dell’antigene basato su citrato nell’autoclave:Posizionare i vetrini in un portavetrini a prova di autoclave in un cestello riempito con tampone citrato (Tabella supplementare 1). Posizionare il cestello nell’autoclave ed eseguire un ciclo di autoclave (pressione: 10 PSI; temperatura: 121 °C; tempo: 15 min). Quando l’autoclave è depressurizzata, recuperare il cestello contenente i vetrini e metterlo in un bagno d’acqua RT per portare i vetrini a RT.NOTA: La strategia di recupero dell’antigene dipende dall’anticorpo utilizzato. Fare riferimento alla scheda tecnica del fornitore per eseguire il recupero dell’antigene più adeguato. Posizionare i vetrini orizzontalmente, con il lato rivolto verso l’alto, su un vassoio di incubazione. Aggiungere 500 μL di tampone bloccante contenente l’1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS sulla parte superiore e incubare per 1 ora. Rimuovere il buffer di blocco. Preparare la soluzione anticorpale aggiungendo 1 μL di antigene-antigene nucleolare umano a 500 μL di tampone bloccante per vetrino da colorare. Aggiungere la soluzione anticorpale a ciascun vetrino. Incubare per una notte in un vassoio di incubazione umidificato a 4 °C. Il giorno dopo, lavare le diapositive 3 volte in PBS. Incubare i vetrini con anticorpo secondario HRP anti-topo non diluito per 45 minuti. Lavare i vetrini 3 volte in PBS.CAUTELA. In una cappa chimica, preparare il tampone DAB (Tabella supplementare 1). Incubare i vetrini con buffer DAB per 10 min. Eliminare qualsiasi materiale di scarto nei contenitori dei rifiuti liquidi chimici organici. Lavare i vetrini con acqua. Incubare i vetrini per 2 minuti in ematossilina per contrastare i nuclei. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 10 minuti. Disidratare i vetrini incubandoli per 1 minuto ciascuno in 50% etanolo, 60% etanolo, 70% etanolo, 80% etanolo e 90% etanolo, 1 min in etanolo al 96% (2x), 1 min in etanolo al 100% (2x) e 1 min in xilene (2x). Racchiudere le guide con un supporto di montaggio e una copertina. Dopo l’asciugatura per circa 20 minuti, osservare i vetrini al microscopio.I>