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Ensaios de citotoxicidade com linhagens celulares de peixe-zebra

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade comumente utilizados (ensaios de Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red e MTT) adaptados para a avaliação da citotoxicidade em linhagens celulares de embrião de peixe-zebra (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços.

Abstract

As linhagens celulares de peixes têm se tornado cada vez mais utilizadas em estudos de ecotoxicidade, e ensaios de citotoxicidade têm sido propostos como métodos para prever a toxicidade aguda de peixes. Assim, este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade modificados para avaliar a viabilidade celular em linhagens celulares de peixe-zebra (Danio rerio) embrionário (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços. Os desfechos de citotoxicidade avaliados são a integridade mitocondrial (ensaios de Alamar Blue [AB] e MTT), a integridade da membrana via atividade da esterase (ensaio CFDA-AM) e a integridade da membrana lisossômica (ensaio Vermelho Neutro [NR]). Após a exposição das substâncias em estudo numa placa de 96 poços, são realizados os ensaios de citotoxicidade; aqui, AB e CFDA-AM são realizados simultaneamente, seguidos de NR na mesma placa, enquanto o ensaio MTT é realizado em uma placa separada. As leituras para esses ensaios são tomadas por fluorescência para AB e CFDA-AM, e absorbância para MTT e NR. Os ensaios de citotoxicidade realizados com estas linhagens celulares de peixes podem ser utilizados para estudar a toxicidade aguda de substâncias químicas em peixes.

Introduction

As substâncias químicas têm de ser testadas quanto à sua segurança para a saúde humana e para o ambiente. Biomarcadores moleculares e celulares têm sido cada vez mais considerados em avaliações de segurança para predizer efeitos em organismos vivos por agências reguladoras e/ou legislações (por exemplo, REACH, OCDE, EUA EPA)1,2, uma vez que podem preceder o desfecho adverso in vivo (por exemplo, desregulação endócrina, resposta imunológica, toxicidade aguda, fototoxicidade)3,4,5,6,7 . Nesse contexto, a citotoxicidade tem sido tomada como medida para predizer a toxicidade aguda dos peixes 5,8; no entanto, pode ter muitas outras aplicações em estudos de ecotoxicidade, como a definição de concentrações subcitotóxicas de substâncias químicas para estudar seu conjunto mais diversificado de efeitos em peixes (por exemplo, efeitos desreguladores endócrinos).

Em sistemas de cultura celular (sistemas in vitro ), a citotoxicidade de substâncias químicas pode ser determinada por métodos diferentes nos tipos de parâmetros. Por exemplo, um método de citotoxicidade pode ser baseado em um desfecho relacionado à morfologia específica observada durante o processo de morte celular, enquanto outro pode determinar a citotoxicidade pela medição da morte celular, viabilidade e funcionalidade, morfologia, metabolismo energético e fixação e proliferação celular. As substâncias químicas podem afetar a viabilidade celular por meio de diferentes mecanismos, portanto, a avaliação da citotoxicidade abrangendo diferentes desfechos de viabilidade celular é necessária para predizer os efeitos químicos9.

MTT e Alamar Blue (AB) são ensaios que determinam os efeitos sobre a viabilidade celular com base na atividade metabólica celular. O ensaio MTT avalia a atividade da enzima mitocondrial succinato desidrogenase10. A redução do brometo amarelado de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para o azul formazano ocorre apenas em células viáveis, e sua densidade óptica é diretamente proporcional ao número de células viáveis10. O ensaio AB é um indicador sensível de oxidação-redução, mediado por enzimas mitocondriais que fluorescem e mudam de cor ao reduzir a resazurina a resorufina por células vivas11; no entanto, enzimas citosólicas e microssômicas também contribuem para a redução de AB e MTT12. Essas enzimas podem incluir várias redutases, como álcool e aldeído oxidorredutases, NAD(P)H: quinona oxidorredutase, flavina redutase, NADH desidrogenase e citocromos11.

O ensaio de Vermelho Neutro (NR) é um ensaio de viabilidade celular baseado na incorporação desse corante nos lisossomos de células viáveis13. A absorção de NR depende da capacidade das células de manter gradientes de pH. O gradiente de prótons dentro dos lisossomos mantém um pH inferior ao citoplasma. Em pH fisiológico normal, o NR apresenta uma carga líquida de aproximadamente zero, o que lhe permite penetrar nas membranas celulares. Assim, o corante torna-se carregado e é retido dentro dos lisossomos. Consequentemente, quanto maior a quantidade de NR retido, maior o número de células viáveis14. Substâncias químicas que danificam a superfície celular ou membranas lisossômicas prejudicam a absorção desse corante.

O ensaio CFDA-AM é um ensaio de viabilidade celular fluorométrico baseado na retenção de éster acetato de acetato de 5-carboxifluoresceína acetoximetílico (CFDA-AM)15. A 5-CFDA-AM, substrato da esterase, é convertida em carboxifluoresceína, substância fluorescente polar e não permeável por membranas de células vivas15; assim, é retido no lado interno de uma membrana celular intacta, indicando células viáveis.

Recentemente, três ensaios de citotoxicidade (ensaios CFDA-AM, NR e AB) foram combinados em uma diretriz ISO (International Organization for Standardization) validada (ISO 21115:2019)16 e método de teste da OCDE (Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico) (OCDE TG 249) para avaliar a toxicidade aguda de peixes usando a linhagem celular RTgill-W1 (linhagem celular permanente da guelra da truta arco-íris [Oncorhynchus mykiss]) em placas de 24 poços17 . Embora exista um método baseado em células para prever a toxicidade aguda dos peixes, esforços têm sido investidos no desenvolvimento de métodos semelhantes com outras espécies de peixes e no aumento do rendimento do método. Alguns exemplos incluem o desenvolvimento de linhagens celulares ZFL transfectadas com genes repórteres para vias de toxicidade específicas18,19, testes de fototoxicidade na linhagem celular RTgill-W1 20 e o uso de linhagens celulares ZFL e ZF4 (fibroblásticos de peixe-zebra derivados de embriões de 1 dia de idade) para avaliar a toxicidade por vários ensaios de citotoxicidade21.

Danio rerio (peixe-zebra) é uma das principais espécies de peixes utilizadas em estudos de toxicidade aquática; assim, métodos baseados em células com linhagens celulares de peixe-zebra para testes de toxicidade de peixes podem ser extremamente úteis. A linhagem celular ZFL é uma linhagem celular epitelial de hepatócitos zebrafish que apresenta as principais características das células parenquimatosas hepáticas e pode metabolizar xenobióticos 7,22,23,24,25. Enquanto isso, a linhagem celular ZEM2S é uma linhagem celular fibroblástica embrionária de peixe-zebra derivada do estágio de blástula que pode ser usada para investigar os efeitos do desenvolvimento em peixes26,27. Assim, este protocolo descreve quatro ensaios de citotoxicidade (ensaios de MTT, AB, NR e CFDA-AM), com modificações a serem realizadas com linhagens celulares ZFL e ZEM2S em placas de 96 poços.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais utilizados neste protocolo e a Tabela 1 para a composição das soluções e meios utilizados neste protocolo. 1. Preparação das células ZFL e ZEM2S Comece por um balão T75 de células ZFL ou ZEM2S com 80% de confluência, cultivadas no respectivo meio completo a 28 °C sem CO2. Retirar o meio de cultura do balão e lavar as células adicionando 1…

Representative Results

A Figura 3 mostra as placas dos ensaios AB, CFDA-AM, NR e MTT. Para o ensaio AB (Figura 3A), os poços em branco e os poços com nenhum ou menor número de células viáveis apresentam coloração azul e baixa fluorescência, enquanto os poços com alto número de células viáveis são rosados e apresentam altos valores de fluorescência devido à transformação da resazurina (AB) em resorufina (substância rosada) pelas células viáveis. Para o ensaio CFDA-A…

Discussion

Os ensaios de citotoxicidade são amplamente utilizados para avaliação de toxicidade in vitro, e este artigo de protocolo apresenta quatro ensaios de citotoxicidade comumente utilizados modificados para serem realizados em linhagens celulares de peixe-zebra (ou seja, densidade celular para placa de 96 poços, tempo de incubação no ensaio MTT, depleção de FBS durante a condição de exposição química e concentração máxima aceitável para o SC). Como esses ensaios quantificam a citotoxicidade por difer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado à promoção da pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade de equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
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References

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Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
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