JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Dit protocol presenteert veelgebruikte cytotoxiciteitstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red en MTT-assays) aangepast voor de beoordeling van cytotoxiciteit in zebravisembryo’s (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen.

Abstract

Viscellijnen worden steeds vaker gebruikt in ecotoxiciteitsstudies en cytotoxiciteitstests zijn voorgesteld als methoden om acute toxiciteit van vissen te voorspellen. Dit protocol presenteert dus cytotoxiciteitstests die zijn aangepast om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren in zebravis (Danio rerio) embryo (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen. De geëvalueerde cytotoxiciteitseindpunten zijn mitochondriale integriteit (Alamar Blue [AB] en MTT-assays), membraanintegriteit via esterase-activiteit (CFDA-AM-assay) en lysosomale membraanintegriteit (Neutral Red [NR] assay). Na de blootstelling van de teststoffen in een plaat met 96 putten worden de cytotoxiciteitstests uitgevoerd; hier worden AB en CFDA-AM gelijktijdig uitgevoerd, gevolgd door NR op dezelfde plaat, terwijl de MTT-test op een afzonderlijke plaat wordt uitgevoerd. De uitlezingen voor deze testen worden genomen door fluorescentie voor AB en CFDA-AM, en absorptie voor MTT en NR. De cytotoxiciteitstests die met deze viscellijnen worden uitgevoerd, kunnen worden gebruikt om de acute toxiciteit van chemische stoffen op vissen te bestuderen.

Introduction

Chemische stoffen moeten worden getest op hun veiligheid voor de menselijke gezondheid en het milieu. Moleculaire en cellulaire biomarkers worden in toenemende mate overwogen in veiligheidsbeoordelingen om effecten op levende organismen te voorspellen door regelgevende instanties en/of wetgevingen (bijv. REACH, OESO, US EPA)1,2, omdat ze kunnen voorafgaan aan de in vivo nadelige uitkomst (bijv. endocriene verstoring, immunologische respons, acute toxiciteit, fototoxiciteit)3,4,5,6,7 . In deze context is cytotoxiciteit als een meting genomen om de acute toxiciteit bij vissente voorspellen 5,8; Het kan echter vele andere toepassingen hebben in ecotoxiciteitsstudies, zoals het definiëren van subcytotoxische concentraties van chemische stoffen om hun meest uiteenlopende reeks effecten op vissen te bestuderen (bijv. Hormoonontregelende effecten).

In celkweeksystemen (in vitro systemen) kan de cytotoxiciteit van chemische stoffen worden bepaald door methoden die verschillen in de soorten eindpunten. Een cytotoxiciteitsmethode kan bijvoorbeeld worden gebaseerd op een eindpunt dat verband houdt met specifieke morfologie die wordt waargenomen tijdens het celdoodproces, terwijl een andere cytotoxiciteit kan bepalen door de meting van celdood, levensvatbaarheid en functionaliteit, morfologie, energiemetabolisme en celaanhechting en -proliferatie. Chemische stoffen kunnen de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden via verschillende mechanismen, dus cytotoxiciteitsbeoordeling met betrekking tot verschillende eindpunten van de levensvatbaarheid van cellen is noodzakelijk om chemische effectente voorspellen 9.

MTT en Alamar Blue (AB) zijn testen die effecten op de levensvatbaarheid van cellen bepalen op basis van celstofwisselingsactiviteit. De MTT-test evalueert de activiteit van het mitochondriale enzym succinaatdehydrogenase10. De reductie van geelachtig 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) tot formazanblauw komt alleen voor in levensvatbare cellen en de optische dichtheid is recht evenredig met het aantal levensvatbare cellen10. De AB-test is een gevoelige oxidatie-reductie-indicator, gemedieerd door mitochondriale enzymen die fluoresceren en van kleur veranderen bij het reduceren van resazurine tot resorufine door levende cellen11; cytosolische en microsomale enzymen dragen echter ook bij aan de reductie van AB en MTT12. Deze enzymen kunnen verschillende reductasen omvatten, zoals alcohol en aldehydeoxidoreductasen, NAD (P) H: chinonoxidoreductase, flavinereductase, NADH-dehydrogenase en cytochromen11.

De Neutral Red (NR) assay is een cel levensvatbaarheidstest gebaseerd op de opname van deze kleurstof in de lysosomen van levensvatbare cellen13. De opname van NR hangt af van het vermogen van de cellen om pH-gradiënten te behouden. De protongradiënt in de lysosomen handhaaft een pH lager dan het cytoplasma. Bij normale fysiologische pH presenteert de NR een nettolading van ongeveer nul, waardoor het celmembranen kan binnendringen. De kleurstof wordt dus geladen en wordt vastgehouden in de lysosomen. Bijgevolg, hoe groter de hoeveelheid behouden NR, hoe groter het aantal levensvatbare cellen14. Chemische stoffen die het celoppervlak of de lysosomale membranen beschadigen, belemmeren de opname van deze kleurstof.

De CFDA-AM-test is een fluorometrische levensvatbaarheidstest voor cellen op basis van de retentie van 5-carboxyfluoresceïnediacetaat acetoxymethylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, een esterasesubstraat, wordt omgezet in carboxyfluoresceïne, een fluorescerende stof die polair en niet-permeabel is door membranen van levende cellen15; Het wordt dus vastgehouden in de binnenkant van een intact celmembraan, wat wijst op levensvatbare cellen.

Onlangs werden drie cytotoxiciteitstests (CFDA-AM, NR en AB-assays) gecombineerd in een gevalideerde ISO-richtlijn (International Organization for Standardization) (ISO 21115: 2019) 16 en OESO-testmethode (Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling) (OESO TG 249) om de acute toxiciteit van vissen te evalueren met behulp van de RTgill-W1-cellijn (permanente cellijn van regenboogforel [Oncorhynchus mykiss] kieuw) in 24-putplaten17 . Hoewel er een bestaande celgebaseerde methode is om de acute toxiciteit van vissen te voorspellen, zijn er inspanningen geleverd om vergelijkbare methoden met andere vissoorten te ontwikkelen en de doorvoer van de methode te vergroten. Enkele voorbeelden zijn de ontwikkeling van ZFL-cellijnen getransfecteerd met reportergenen voor specifieke toxiciteitsroutes18,19, fototoxiciteitstests in de RTgill-W1-cellijn 20 en het gebruik van ZFL- en ZF4-cellijnen (zebravisfibroblast afgeleid van embryo’s van 1 dag oud) om toxiciteit te beoordelen door middel van verschillende cytotoxiciteitstests21.

Danio rerio (zebravis) is een van de belangrijkste vissoorten die worden gebruikt in aquatische toxiciteitsstudies; Celgebaseerde methoden met zebraviscellijnen voor het testen van vistoxiciteit kunnen dus uiterst nuttig zijn. De ZFL-cellijn is een zebravisepitheelhepatocytencellijn die de belangrijkste kenmerken van leverparenchymale cellen presenteert en xenobiotica kan metaboliseren 7,22,23,24,25. Ondertussen is de ZEM2S-cellijn een embryonale zebravis fibroblastische cellijn afgeleid van het blastulastadium die kan worden gebruikt om ontwikkelingseffecten op vissen te onderzoeken26,27. Dit protocol beschrijft dus vier cytotoxiciteitstests (MTT-, AB-, NR- en CFDA-AM-assays), met modificaties die moeten worden uitgevoerd met ZFL- en ZEM2S-cellijnen in 96-putplaten.

Protocol

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor de lijst van materialen die in dit protocol worden gebruikt en tabel 1 voor de samenstelling van de in dit protocol gebruikte oplossingen en media. 1. ZFL- en ZEM2S-cellen voorbereiden Begin met een T75-kolf van ZFL- of ZEM2S-cellen met 80% confluentie, gekweekt in het betreffende volledige medium bij 28 °C zonder CO2. Haal het kweekmedium uit de kolf en was de cellen door t…

Representative Results

Figuur 3 toont de platen van de AB-, CFDA-AM-, NR- en MTT-assays. Voor de AB-test (figuur 3A) vertonen de lege putten en putten met geen of een verminderd aantal levensvatbare cellen een blauwe kleur en een lage fluorescentie, terwijl de putten met een groot aantal levensvatbare cellen roze zijn en hoge fluorescentiewaarden vertonen als gevolg van de transformatie van resazurine (AB) in resorufine (roze substantie) door de levensvatbare cellen. Voor de CFDA-AM-t…

Discussion

Cytotoxiciteitstests worden veel gebruikt voor in vitro toxiciteitsevaluatie en dit protocolartikel presenteert vier veelgebruikte cytotoxiciteitstests die zijn aangepast om te worden uitgevoerd in zebraviscellijnen (d.w.z. celdichtheid voor 96-putplaat, incubatietijd in de MTT-test, FBS-depletie tijdens de chemische blootstellingsconditie en maximaal aanvaardbare concentratie voor de SC). Aangezien deze testen cytotoxiciteit kwantificeren door verschillende eindpunten van de levensvatbaarheid van cellen (metabo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ter nagedachtenis aan Dr. Márcio Lorencini, een co-auteur van dit werk, een uitstekende onderzoeker op het gebied van cosmetica en toegewijd aan het bevorderen van cosmetisch onderzoek in Brazilië. De auteurs zijn dankbaar voor het Multi-user Laboratory in de afdeling Fysiologie (UFPR) voor de beschikbaarheid van apparatuur en voor de financiële steun van de Coördinatie voor de Verbetering van het Personeel van het Hoger Onderwijs (CAPES, Brazilië) (Finance Code 001) en de Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022)
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019)
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. . Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -. H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD’s fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023)
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesZEM2SZFL96-well PlateCell ViabilityAcute ToxicityEcotoxicityAlternative Fish AssaysHepatocytesEmbryonic CellsCell SuspensionMulti-channel PipetteTest ChemicalsTriton X-100Exposure Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image