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Environment

Saggi di citotossicità con linee cellulari di zebrafish

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Questo protocollo presenta saggi di citotossicità comunemente usati (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red, e MTT assays) adattati per la valutazione della citotossicità in linee cellulari di embrioni di zebrafish (ZEM2S) e fegato (ZFL) in piastre a 96 pozzetti.

Abstract

Le linee cellulari di pesce sono diventate sempre più utilizzate negli studi di ecotossicità e sono stati proposti saggi di citotossicità come metodi per prevedere la tossicità acuta dei pesci. Pertanto, questo protocollo presenta saggi di citotossicità modificati per valutare la vitalità cellulare in linee cellulari embrionali di zebrafish (Danio rerio) (ZEM2S) e fegato (ZFL) in piastre a 96 pozzetti. Gli endpoint di citotossicità valutati sono l’integrità mitocondriale (saggi Alamar Blue [AB] e MTT), l’integrità della membrana attraverso l’attività esterasi (test CFDA-AM) e l’integrità della membrana lisosomiale (saggio Neutral Red [NR]). Dopo l’esposizione delle sostanze in esame in una piastra a 96 pozzetti, vengono eseguiti i saggi di citotossicità; qui, AB e CFDA-AM vengono eseguiti contemporaneamente, seguiti da NR sulla stessa piastra, mentre il saggio MTT viene eseguito su una piastra separata. Le letture per questi test sono prese per fluorescenza per AB e CFDA-AM e assorbanza per MTT e NR. I saggi di citotossicità eseguiti con queste linee cellulari di pesce possono essere utilizzati per studiare la tossicità acuta delle sostanze chimiche sui pesci.

Introduction

Le sostanze chimiche devono essere testate per quanto riguarda la loro sicurezza per la salute umana e l’ambiente. I biomarcatori molecolari e cellulari sono stati sempre più considerati nelle valutazioni di sicurezza per prevedere gli effetti sugli organismi viventi da parte di agenzie e/o legislazioni regolatorie (ad esempio, REACH, OCSE, US EPA)1,2, poiché possono precedere l’esito avverso in vivo (ad esempio, interferenza endocrina, risposta immunologica, tossicità acuta, fototossicità)3,4,5,6,7 . In questo contesto, la citotossicità è stata presa come misura per prevedere la tossicità acuta dei pesci 5,8; Tuttavia, può avere molte altre applicazioni negli studi di ecotossicità, come la definizione di concentrazioni sub-citotossiche di sostanze chimiche per studiare il loro insieme più diversificato di effetti sui pesci (ad esempio, effetti di interferenza endocrina).

Nei sistemi di coltura cellulare (sistemi in vitro ), la citotossicità delle sostanze chimiche può essere determinata con metodi diversi nei tipi di endpoint. Ad esempio, un metodo di citotossicità può essere basato su un endpoint correlato alla morfologia specifica osservata durante il processo di morte cellulare, mentre un altro può determinare la citotossicità misurando la morte cellulare, la vitalità e la funzionalità, la morfologia, il metabolismo energetico e l’attaccamento e la proliferazione cellulare. Le sostanze chimiche possono influenzare la vitalità cellulare attraverso diversi meccanismi, pertanto la valutazione della citotossicità che copra diversi endpoint di vitalità cellulare è necessaria per prevedere gli effetti chimici9.

MTT e Alamar Blue (AB) sono saggi che determinano gli effetti sulla vitalità cellulare in base all’attività metabolica cellulare. Il test MTT valuta l’attività dell’enzima mitocondriale succinato deidrogenasi10. La riduzione del 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) giallastro al blu formazan si verifica solo nelle cellule vitali e la sua densità ottica è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali10. Il saggio AB è un indicatore sensibile di ossido-riduzione, mediato da enzimi mitocondriali che fluoreggiano e cambiano colore dopo aver ridotto la resazurina a resorufin da parte delle cellule viventi11; tuttavia, anche gli enzimi citosolici e microsomiali contribuiscono alla riduzione di AB e MTT12. Questi enzimi possono includere diverse reduttasi, come alcol e aldeide ossidoreduttasi, NAD(P)H: chinone ossidoreduttasi, flavina reduttasi, NADH deidrogenasi e citocromi11.

Il test Neutral Red (NR) è un test di vitalità cellulare basato sull’incorporazione di questo colorante nei lisosomi delle cellule vitali13. L’assorbimento di NR dipende dalla capacità delle cellule di mantenere gradienti di pH. Il gradiente protonico all’interno dei lisosomi mantiene un pH inferiore al citoplasma. A pH fisiologico normale, il NR presenta una carica netta di circa zero, che gli consente di penetrare nelle membrane cellulari. Pertanto, il colorante si carica e viene trattenuto all’interno dei lisosomi. Di conseguenza, maggiore è la quantità di NR trattenuto, maggiore è il numero di cellule vitali14. Le sostanze chimiche che danneggiano la superficie cellulare o le membrane lisosomiali compromettono l’assorbimento di questo colorante.

Il test CFDA-AM è un test di vitalità cellulare fluorometrica basato sulla ritenzione di 5-carbossimetilestere diacetato di diacetato di 5-carbossimetile (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, un substrato di esterasi, viene convertito in carbossifluoresceina, una sostanza fluorescente polare e non permeabile dalle membrane delle cellule viventi15; Pertanto, viene trattenuto nella parte interna di una membrana cellulare intatta, indicando cellule vitali.

Recentemente, tre saggi di citotossicità (saggi CFDA-AM, NR e AB) sono stati combinati in una linea guida ISO (International Organization for Standardization) convalidata (ISO 21115: 2019) 16 e un metodo di prova dell’OCSE (Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico) (OCSE TG 249) per valutare la tossicità acuta dei pesci utilizzando la linea cellulare RTgill-W1 (linea cellulare permanente dalla branchia della trota iridea [Oncorhynchus mykiss]) in piastre a 24 pozzetti17 . Sebbene esista un metodo basato su cellule per prevedere la tossicità acuta dei pesci, sono stati investiti sforzi nello sviluppo di metodi simili con altre specie ittiche e nell’aumento della produttività del metodo. Alcuni esempi includono lo sviluppo di linee cellulari ZFL trasfettate con geni reporter per specifiche vie di tossicità18,19, test di fototossicità nella linea cellulare RTgill-W1 20 e l’uso di linee cellulari ZFL e ZF4 (fibroblasti zebrafish derivati da embrioni di 1 giorno) per valutare la tossicità mediante diversi saggi di citotossicità21.

Danio rerio (zebrafish) è una delle principali specie ittiche utilizzate negli studi di tossicità acquatica; Pertanto, i metodi basati su cellule con linee cellulari di zebrafish per i test di tossicità dei pesci possono essere estremamente utili. La linea cellulare ZFL è una linea cellulare di epatociti epiteliali zebrafish che presenta le principali caratteristiche delle cellule parenchimali epatiche e può metabolizzare xenobiotici 7,22,23,24,25. Nel frattempo, la linea cellulare ZEM2S è una linea cellulare fibroblastica embrionale di zebrafish derivata dallo stadio di blastula che può essere utilizzata per studiare gli effetti sullo sviluppo sui pesci26,27. Pertanto, questo protocollo descrive quattro saggi di citotossicità (saggi MTT, AB, NR e CFDA-AM), con modifiche da eseguire con linee cellulari ZFL e ZEM2S in piastre a 96 pozzetti.

Protocol

NOTA: vedere la Tabella dei materiali per l’elenco dei materiali utilizzati in questo protocollo e la Tabella 1 per la composizione delle soluzioni e dei supporti utilizzati in questo protocollo. 1. Preparazione delle celle ZFL e ZEM2S Iniziare con un matraccio T75 di cellule ZFL o ZEM2S con confluenza dell’80%, coltivate nel rispettivo mezzo completo a 28 °C senza CO2. Rimuovere il terreno di coltura dal matrac…

Representative Results

La Figura 3 mostra le piastre dei saggi AB, CFDA-AM, NR e MTT. Per il saggio AB (Figura 3A), i pozzetti vuoti e i pozzetti con nessun o un numero ridotto di cellule vitali mostrano colore blu e bassa fluorescenza, mentre i pozzetti con un alto numero di cellule vitali sono rosati e presentano alti valori di fluorescenza a causa della trasformazione della resazurina (AB) in resorufin (sostanza rosata) da parte delle cellule vitali. Per il test CFDA-AM, non vi è …

Discussion

I saggi di citotossicità sono ampiamente utilizzati per la valutazione della tossicità in vitro e questo articolo di protocollo presenta quattro saggi di citotossicità comunemente usati modificati per essere eseguiti in linee cellulari di zebrafish (cioè densità cellulare per piastra a 96 pozzetti, tempo di incubazione nel test MTT, deplezione di FBS durante la condizione di esposizione chimica e concentrazione massima accettabile per il SC). Poiché questi saggi quantificano la citotossicità in base a div…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

In memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautore di questo lavoro, eccellente ricercatore nel campo della cosmesi e dedito alla promozione della ricerca cosmetica in Brasile. Gli autori sono grati al Multi-user Laboratory del Dipartimento di Fisiologia (UFPR) per la disponibilità delle attrezzature e per il sostegno finanziario del Coordinamento per il miglioramento del personale dell’istruzione superiore (CAPES, Brasile) (Codice finanziario 001) e del Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
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Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
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