Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra

Las sustancias químicas deben ser probadas en cuanto a su seguridad para la salud humana y el medio ambiente. Los biomarcadores moleculares y celulares se han considerado cada vez más en las evaluaciones de seguridad para predecir los efectos en los organismos vivos por parte de las agencias reguladoras y/o legislaciones (por ejemplo, REACH, OCDE, US EPA^)1,2, ya que pueden preceder al resultado adverso in vivo (por ejemplo, alteración endocrina, respuesta inmunológica, toxicidad aguda, fototoxicidad)3,4,5,6,7 . En este contexto, la citotoxicidad ha sido tomada como medida para predecir la toxicidad aguda de los peces ^5,8; Sin embargo, puede tener muchas otras aplicaciones en estudios de ecotoxicidad, como la definición de concentraciones subcitotóxicas de sustancias químicas para estudiar su conjunto más diverso de efectos en los peces (por ejemplo, efectos de alteración endocrina).

En los sistemas de cultivo celular (sistemas in vitro ), la citotoxicidad de las sustancias químicas puede determinarse mediante métodos que difieren en los tipos de criterios de valoración. Por ejemplo, un método de citotoxicidad puede basarse en un punto final relacionado con la morfología específica observada durante el proceso de muerte celular, mientras que otro puede determinar la citotoxicidad mediante la medición de la muerte celular, la viabilidad y funcionalidad, la morfología, el metabolismo energético y la unión y proliferación celular. Las sustancias químicas pueden afectar la viabilidad celular a través de diferentes mecanismos, por lo que la evaluación de la citotoxicidad que cubre diferentes criterios de valoración de la viabilidad celular es necesaria para predecir los efectos químicos⁹.

MTT y Alamar Blue (AB) son ensayos que determinan los efectos sobre la viabilidad celular en función de la actividad metabólica celular. El ensayo MTT evalúa la actividad de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa¹⁰. La reducción del bromuro amarillento de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a azul de formazán ocurre solo en células viables, y su densidad óptica es directamente proporcional al número de células viables¹⁰. El ensayo AB es un indicador sensible de oxidación-reducción, mediado por enzimas mitocondriales que emiten fluorescencia y cambian de color al reducir la resazurina a resorufina por las células vivas¹¹; sin embargo, las enzimas citosólicas y microsomales también contribuyen a la reducción de AB y MTT¹². Estas enzimas pueden incluir varias reductasas, como alcohol y aldehído oxidorreductasas, NAD(P)H: quinona oxidorreductasa, flavina reductasa, NADH deshidrogenasa y citocromos¹¹.

El ensayo Neutral Red (NR) es un ensayo de viabilidad celular basado en la incorporación de este colorante en los lisosomas de células viables¹³. La absorción de NR depende de la capacidad de las células para mantener gradientes de pH. El gradiente de protones dentro de los lisosomas mantiene un pH más bajo que el citoplasma. A pH fisiológico normal, el NR presenta una carga neta de aproximadamente cero, lo que le permite penetrar en las membranas celulares. Por lo tanto, el tinte se carga y se retiene dentro de los lisosomas. En consecuencia, cuanto mayor es la cantidad de NR retenida, mayor es el número de células viables¹⁴. Las sustancias químicas que dañan la superficie celular o las membranas lisosomales perjudican la absorción de este colorante.

El ensayo CFDA-AM es un ensayo de viabilidad celular fluorométrica basado en la retención de éster acetoxymetilo de diacetato de 5-carboxifluoresceína (CFDA-AM)¹⁵. La 5-CFDA-AM, sustrato de esterasa, se convierte en carboxifluoresceína, sustancia fluorescente que es polar y no permeable por las membranas de las células vivas¹⁵; Por lo tanto, se retiene en el lado interno de una membrana celular intacta, lo que indica células viables.

Recientemente, se combinaron tres ensayos de citotoxicidad (ensayos CFDA-AM, NR y AB) en una guía ISO (Organización Internacional de Normalización) validada (ISO 21115: 2019)¹⁶ y un método de prueba de la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos) (OCDE TG 249) para evaluar la toxicidad aguda de los peces utilizando la línea celular RTgill-W1 (línea celular permanente de trucha arco iris [Oncorhynchus mykiss] branquia) en placas de 24 pocillos¹⁷ . Aunque existe un método basado en células para predecir la toxicidad aguda de los peces, se han invertido esfuerzos en desarrollar métodos similares con otras especies de peces y aumentar el rendimiento del método. Algunos ejemplos incluyen el desarrollo de líneas celulares ZFL transfectadas con genes reporteros para vías de toxicidad específicas^18,19, pruebas de fototoxicidad en la línea celular RTgill-W1 20^, y el uso de líneas celulares ZFL y ZF4 (fibroblástico de pez cebra derivado de embriones de 1 día de edad) para evaluar la toxicidad mediante varios ensayos de citotoxicidad²¹.

Danio rerio (pez cebra) es una de las principales especies de peces utilizadas en estudios de toxicidad acuática; Por lo tanto, los métodos basados en células con líneas celulares de pez cebra para pruebas de toxicidad de peces pueden ser extremadamente útiles. La línea celular ZFL es una línea celular de hepatocitos epiteliales de pez cebra que presenta las principales características de las células del parénquima hepático y puede metabolizar xenobióticos 7,22,23,24,25. Mientras tanto, la línea celular ZEM2S es una línea celular fibroblástica embrionaria de pez cebra derivada de la etapa de blástula que puede usarse para investigar los efectos del desarrollo en peces^26,27. Por lo tanto, este protocolo describe cuatro ensayos de citotoxicidad (ensayos MTT, AB, NR y CFDA-AM), con modificaciones que se realizarán con líneas celulares ZFL y ZEM2S en placas de 96 pocillos.