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Environment

ゼブラフィッシュ細胞株を用いた細胞毒性アッセイ

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

このプロトコルは、96ウェルプレートのゼブラフィッシュ胚(ZEM2S)および肝臓(ZFL)細胞株の細胞毒性の評価に適した、一般的に使用される細胞毒性アッセイ(Alamar Blue [AB]、CFDA-AM、ニュートラルレッド、およびMTTアッセイ)を提示します。

Abstract

魚類細胞株は生態毒性試験でますます使用されるようになり、細胞毒性アッセイは魚類の急性毒性を予測する方法として提案されている。したがって、このプロトコルは、96ウェルプレートのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)胚(ZEM2S)および肝臓(ZFL)細胞株における細胞生存率を評価するために改変された細胞毒性アッセイを提示します。評価された細胞毒性エンドポイントは、ミトコンドリアの完全性(Alamar Blue [AB]およびMTTアッセイ)、エステラーゼ活性 を介した 膜の完全性(CFDA-AMアッセイ)、およびリソソーム膜の完全性(ニュートラルレッド[NR]アッセイ)です。96ウェルプレートに試験物質を曝露した後、細胞毒性アッセイが行われます。ここでは、ABおよびCFDA-AMが同時に行われ、続いて同じプレート上でNRが行われ、一方、MTTアッセイは別のプレート上で行われる。これらのアッセイの読み出しは、ABおよびCFDA-AMの蛍光、MTTおよびNRの吸光度によって取得されます。これらの魚細胞株を用いて実施される細胞毒性アッセイは、魚に対する化学物質の急性毒性を研究するために使用することができる。

Introduction

化学物質は、人の健康と環境に対する安全性についてテストする必要があります。分子および細胞バイオマーカーは、in vivoの有害転帰(内分泌かく乱、免疫学的反応、急性毒性、光毒性など)に先行する可能性があるため、規制当局および/または法律(REACH、OECD、US EPAなど)1,2による生物への影響を予測するための安全性評価においてますます考慮されています3,4,5,6,7。.これに関連して、細胞毒性は、魚類の急性毒性を予測するための測定値として採用されている5,8;しかし、化学物質のサブ細胞毒性濃度を定義して魚に対する最も多様な影響(内分泌かく乱効果など)を研究するなど、生態毒性研究には他の多くの用途があります。

細胞培養系(in vitro 系)では、化学物質の細胞毒性は、エンドポイントの種類が異なる方法で決定できます。例えば、細胞毒性法は、細胞死プロセス中に観察される特定の形態に関連するエンドポイントに基づくことができ、別の方法は、細胞死、生存率および機能性、形態、エネルギー代謝、ならびに細胞の付着および増殖の測定によって細胞毒性を決定することができる。化学物質はさまざまなメカニズムで細胞生存率に影響を与える可能性があるため、化学的影響を予測するには、さまざまな細胞生存率エンドポイントをカバーする細胞毒性評価が必要です9。

MTTおよびAlamar Blue(AB)は、細胞代謝活性に基づいて細胞生存率への影響を決定するアッセイです。MTTアッセイは、ミトコンドリア酵素コハク酸デヒドロゲナーゼ10の活性を評価する。黄色がかった3-[4,5-ジメチルチアゾール-2イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)のホルマザンブルーへの還元は、生細胞でのみ起こり、その光学密度は生細胞の数に正比例します10。ABアッセイは高感度酸化還元指標であり、生細胞によってレサズリンをレゾルフィンに還元すると蛍光を発し、色が変化するミトコンドリア酵素によって媒介されます11。しかしながら、細胞質およびミクロソーム酵素もまた、ABおよびMTT12の減少に寄与する。これらの酵素には、アルコールおよびアルデヒドオキシドレダクターゼ、NAD(P)H:キノンオキシドレダクターゼ、フラビンレダクターゼ、NADHデヒドロゲナーゼ、およびシトクロム11などのいくつかのレダクターゼが含まれる場合があります。

ニュートラルレッド(NR)アッセイは、生存細胞のリソソームへのこの色素の取り込みに基づく細胞生存率アッセイです13。NRの取り込みは、pH勾配を維持する細胞の能力に依存します。リソソーム内のプロトン勾配は、細胞質よりも低いpHを維持します。通常の生理的pHでは、NRはほぼゼロの正味電荷を示し、細胞膜を透過することができます。したがって、色素は荷電し、リソソームの内部に保持されます。その結果、保持されるNRの量が多いほど、生細胞14の数が多くなる。細胞表面またはリソソーム膜を損傷する化学物質は、この色素の取り込みを損ないます。

CFDA-AMアッセイは、5-カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル(CFDA-AM)15の保持に基づく蛍光細胞生存率アッセイです。エステラーゼ基質である5-CFDA-AMは、極性があり、生細胞の膜によって非透過性の蛍光物質であるカルボキシフルオレセインに変換されます15;したがって、それは無傷の細胞膜の内側に保持され、生存細胞を示す。

最近、3つの細胞毒性アッセイ(CFDA-AM、NR、およびABアッセイ)が、検証済みのISO(国際標準化機構)ガイドライン(ISO 21115:2019)16およびOECD(経済協力開発機構)試験方法(OECD TG 249)で組み合わされ、24ウェルプレートでRTgill-W1細胞株(ニジマス[Oncorhynchus mykiss]ギルからの永久細胞株)を使用して魚の急性毒性を評価しました17.魚類の急性毒性を予測するための既存の細胞ベースの方法がありますが、他の魚種と同様の方法を開発し、その処理量を増やすことに努力が払われてきました。いくつかの例には、特異的毒性経路18、19のためのレポーター遺伝子をトランスフェクトしたZFL細胞株の開発、RTgill−W1細胞株20における光毒性試験、およびいくつかの細胞毒性アッセイ21によって毒性を評価するためのZFLおよびZF4細胞株(1日齢の胚に由来するゼブラフィッシュ線維芽細胞)の使用が含まれる。

ダニオレリオ(ゼブラフィッシュ)は、水生毒性試験で使用される主要な魚種の1つです。したがって、魚類毒性試験のためのゼブラフィッシュ細胞株を用いた細胞ベースの方法は非常に有用であり得る。ZFL細胞株は、肝実質細胞の主な特徴を示し、生体異物を代謝できるゼブラフィッシュ上皮肝細胞株です7、22、23、24、25。一方、ZEM2S細胞株は、胚芽細胞期に由来する胚性ゼブラフィッシュ線維芽細胞株であり、魚類の発生効果を調べるために使用することができる26,27。したがって、このプロトコルは、96ウェルプレート中のZFLおよびZEM2S細胞株を用いて実施される修飾を伴う4つの細胞毒性アッセイ(MTT、AB、NR、およびCFDA-AMアッセイ)を記載しています。

Protocol

注:このプロトコルで使用される材料のリストについては材料表を、このプロトコルで使用される溶液と培地の構成については表1を参照してください。 1. ZFLおよびZEM2Sセルの準備 ZFLまたはZEM2S細胞のT75フラスコを80%コンフルエントで開始し、CO2を含まない28°Cのそれぞれの完全培地中で培養した。 フラスコから…

Representative Results

図3は、AB、CFDA-AM、NR、およびMTTアッセイのプレートを示しています。ABアッセイ(図3A)では、ブランクウェルおよび生存細胞数がない、または生存細胞数が減少したウェルは青色で蛍光が低いのに対し、生細胞数が多いウェルはピンクがかっており、生存細胞によるレサズリン(AB)のレゾルフィン(ピンクがかった物質)への変換により高い蛍光値を示?…

Discussion

細胞毒性アッセイはin vitro毒性評価に広く使用されており、このプロトコル記事では、ゼブラフィッシュ細胞株で実施するように改変された4つの一般的に使用される細胞毒性アッセイ(すなわち、96ウェルプレートの細胞密度、MTTアッセイでのインキュベーション時間、化学物質暴露条件下でのFBS枯渇、およびSCの最大許容濃度)を紹介します。これらのアッセイは、異なる細胞生存率エ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品の共著者であり、化粧品の分野で優れた研究者であり、ブラジルでの化粧品研究の促進に専念しているマルシオ・ロレンチーニ博士を記念して。著者らは、生理学部(UFPR)のマルチユーザーラボラトリーの機器の入手可能性と、高等教育要員の改善のための調整(CAPES、ブラジル)(財務コード001)およびGrupo Boticarioの財政的支援に感謝しています。

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
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References

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Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
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