JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Анализы цитотоксичности с клеточными линиями рыбок данио-рерио

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

В этом протоколе представлены широко используемые анализы цитотоксичности (анализы Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red и MTT), адаптированные для оценки цитотоксичности эмбрионов рыбок данио-рерио (ZEM2S) и клеточных линий печени (ZFL) в 96-луночных планшетах.

Abstract

Клеточные линии рыб стали все чаще использоваться в исследованиях экотоксичности, и анализы цитотоксичности были предложены в качестве методов прогнозирования острой токсичности рыб. Таким образом, в этом протоколе представлены анализы цитотоксичности, модифицированные для оценки жизнеспособности клеток эмбрионов рыбок данио-рерио (Danio rerio) (ZEM2S) и клеточных линий печени (ZFL) в 96-луночных планшетах. Оцениваемыми конечными точками цитотоксичности являются целостность митохондрий (анализы Alamar Blue [AB] и MTT), целостность мембраны через активность эстеразы (анализ CFDA-AM) и целостность лизосомальной мембраны (анализ нейтрального красного [NR]). После экспозиции исследуемых веществ в 96-луночном планшете проводятся анализы цитотоксичности; здесь AB и CFDA-AM проводятся одновременно, за ними следует NR на одной и той же пластине, в то время как анализ MTT выполняется на отдельной пластине. Показания этих анализов снимаются путем флуоресценции для AB и CFDA-AM и абсорбции для MTT и NR. Анализы цитотоксичности, проведенные с этими линиями клеток рыб, могут быть использованы для изучения острой токсичности химических веществ на рыбе.

Introduction

Химические вещества должны быть проверены на предмет их безопасности для здоровья человека и окружающей среды. Молекулярные и клеточные биомаркеры все чаще учитываются при оценке безопасности для прогнозирования воздействия на живые организмы регулирующими органами и/или законодательством (например, REACH, ОЭСР, US EPA)1,2, поскольку они могут предшествовать неблагоприятному исходу in vivo (например, эндокринные нарушения, иммунологический ответ, острая токсичность, фототоксичность)3,4,5,6,7 . В этом контексте цитотоксичность была взята в качестве измерения для прогнозирования острой токсичности рыб 5,8; Тем не менее, он может иметь много других применений в исследованиях экотоксичности, таких как определение субцитотоксических концентраций химических веществ для изучения их самого разнообразного набора эффектов на рыбу (например, эффектов, разрушающих эндокринную систему).

В системах клеточных культур (системах in vitro ) цитотоксичность химических веществ может определяться методами, различающимися по типам конечных точек. Например, метод цитотоксичности может быть основан на конечной точке, связанной со специфической морфологией, наблюдаемой во время процесса гибели клеток, в то время как другой метод может определять цитотоксичность путем измерения гибели клеток, жизнеспособности и функциональности, морфологии, энергетического метаболизма, а также прикрепления и пролиферации клеток. Химические вещества могут влиять на жизнеспособность клеток с помощью различных механизмов, поэтому оценка цитотоксичности, охватывающая различные конечные точки жизнеспособности клеток, необходима для прогнозирования химических эффектов9.

МТТ и Аламар Блю (АБ) – это анализы, которые определяют влияние на жизнеспособность клеток на основе метаболической активности клеток. Анализ МТТ оценивает активность митохондриального фермента сукцинатдегидрогеназы10. Восстановление желтоватого 3-[4,5-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) до формазанового синего происходит только в жизнеспособных клетках, а его оптическая плотность прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток10. Анализ AB является чувствительным окислительно-восстановительным индикатором, опосредованным митохондриальными ферментами, которые флуоресцируют и меняют цвет при восстановлении резазурина до резоруфина живыми клетками11; однако цитозольные и микросомальные ферменты также способствуют снижению AB и MTT12. Эти ферменты могут включать несколько редуктаз, таких как алкоголь и альдегидоксидоредуктазы, NAD(P)H: хиноноксидоредуктаза, флавинредуктаза, НАДН-дегидрогеназа и цитохромы11.

Анализ нейтрального красного (NR) представляет собой анализ жизнеспособности клеток, основанный на включении этого красителя в лизосомы жизнеспособных клеток13. Поглощение NR зависит от способности клеток поддерживать градиенты pH. Градиент протонов внутри лизосом поддерживает рН ниже, чем цитоплазма. При нормальном физиологическом рН NR представляет собой чистый заряд, равный примерно нулю, что позволяет ему проникать через клеточные мембраны. Таким образом, краситель становится заряженным и удерживается внутри лизосом. Следовательно, чем больше количество удерживаемого NR, тем больше число жизнеспособных клеток14. Химические вещества, повреждающие поверхность клеток или лизосомальные мембраны, ухудшают усвоение этого красителя.

Анализ CFDA-AM представляет собой флуорометрический анализ жизнеспособности клеток, основанный на удержании ацетоксиметилового эфира диацетата 5-карбоксифлуоресцеина (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, эстеразный субстрат, превращается в карбоксифлуоресцеин, флуоресцентное вещество, полярное и непроницаемое мембранами живых клеток15; Таким образом, он удерживается во внутренней стороне неповрежденной клеточной мембраны, что указывает на жизнеспособные клетки.

Недавно три анализа цитотоксичности (анализы CFDA-AM, NR и AB) были объединены в утвержденном руководстве ISO (Международная организация по стандартизации) (ISO 21115:2019)16 и методе испытаний ОЭСР (Организация экономического сотрудничества и развития) (OECD TG 249) для оценки острой токсичности рыб с использованием клеточной линии RTgill-W1 (постоянная клеточная линия из жабр радужной форели [Oncorhynchus mykiss]) в 24-луночных планшетах17 . Несмотря на то, что существует клеточный метод прогнозирования острой токсичности рыб, были предприняты усилия по разработке аналогичных методов для других видов рыб и увеличению пропускной способности метода. Некоторые примеры включают разработку клеточных линий ZFL, трансфицированных репортерными генами для специфических путей токсичности18,19, тесты на фототоксичность в клеточной линии RTgill-W120 и использование клеточных линий ZFL и ZF4 (фибробласты рыбок данио, полученные из эмбрионов в возрасте 1 дня) для оценки токсичности с помощью нескольких анализов цитотоксичности21.

Danio rerio (рыбки данио-рерио) является одним из основных видов рыб, используемых в исследованиях токсичности в водной среде; Таким образом, клеточные методы с клеточными линиями рыбок данио-рерио для тестирования токсичности рыб могут быть чрезвычайно полезными. Клеточная линия ZFL представляет собой эпителиальную клеточную линию гепатоцитов рыбок данио, которая представляет основные характеристики паренхиматозных клеток печени и может метаболизировать ксенобиотики 7,22,23,24,25. Между тем, клеточная линия ZEM2S представляет собой эмбриональную фибробластическую клеточную линию рыбок данио, полученную из стадии бластулы, которая может быть использована для исследования влияния на развитие рыб26,27. Таким образом, этот протокол описывает четыре анализа цитотоксичности (анализы MTT, AB, NR и CFDA-AM) с модификациями, которые должны быть выполнены с клеточными линиями ZFL и ZEM2S в 96-луночных планшетах.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для списка материалов, используемых в этом протоколе, и Таблицу 1 для состава растворов и сред, используемых в этом протоколе. 1. Подготовка ячеек ZFL и ZEM2S Начните с колбы T75 из клеток ZFL или ZEM2S с 80% слиянием, к…

Representative Results

На рисунке 3 показаны планшеты анализов AB, CFDA-AM, NR и MTT. Для анализа AB (рис. 3A) пустые лунки и лунки с отсутствующим или уменьшенным числом жизнеспособных клеток показывают синий цвет и низкую флуоресценцию, в то время как лунки с большим количеством жизнесп?…

Discussion

Анализы цитотоксичности широко используются для оценки токсичности in vitro, и в этой протокольной статье представлены четыре широко используемых анализа цитотоксичности, модифицированных для проведения в клеточных линиях рыбок данио-рерио (т.е. плотность клеток для 96-луночного пла…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Памяти доктора Марсио Лоренчини, соавтора этой работы, выдающегося исследователя в области косметики и посвященного продвижению косметических исследований в Бразилии. Авторы выражают благодарность Многопользовательской лаборатории на кафедре физиологии (UFPR) за наличие оборудования и финансовую поддержку Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) (Финансовый код 001) и Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022)
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019)
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. . Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -. H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD’s fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023)
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesZEM2SZFL96-well PlateCell ViabilityAcute ToxicityEcotoxicityAlternative Fish AssaysHepatocytesEmbryonic CellsCell SuspensionMulti-channel PipetteTest ChemicalsTriton X-100Exposure Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image