Op immunostaining gebaseerde detectie van dynamische veranderingen in rode bloedceleiwitten

Rode bloedcellen (RBC’s) doorkruisen het cardiovasculaire systeem gedurende 70 tot 140 dagen, met een gemiddelde RBC-leeftijd van ongeveer 115 dagen ^1,2. Senescente of beschadigde RBC’s worden uit de circulatie verwijderd door erytrofagocytose, een efficiënt zuiveringsproces aangedreven door macrofagen³. De vooraf bepaalde levensduur van deze cellen is een gevolg van het opgeven van de celorganellen, inclusief de kern, mitochondriën en ribosomen, tijdens differentiatie en rijping⁴. Circulerende RBC’s zijn dus verstoken van een translationele machinerie, waardoor de synthese van nieuwe eiwitten^{wordt uitgesloten 3}. Hieruit volgt dat dynamische, posttranslationele modificaties aan bestaande eiwitten het enige levensvatbare mechanisme vormen van acute, biochemische regulatie als reactie op extracellulaire en intracellulaire stressoren die inwerken op RBC’s⁵.

Mechanische krachten lijken de belangrijkste extracellulaire signalen te zijn die de activering of modulatie van biochemische routes binnen RBC’s veroorzaken. De ontdekking van het mechanosensitieve eiwit, Piezo1, in RBC-membranen⁶ inspireerde verschillende onderzoekslijnen naar mechanisch geactiveerde signalering in deze cellen⁷. Recente ontwikkelingen hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de fysische eigenschappen van RBC’s actief worden gereguleerd door acute en dynamische veranderingen van eiwitten⁸, waaronder posttranslationele fosforylering en ubiquitinatie⁹. Aangezien deze normale modificaties verschillen in bepaalde ziekten 9,10,11, lijkt het van wetenschappelijk en klinisch belang om de activeringstoestand van RBC-eiwitten te bepalen^, specifiek met betrekking tot mechanobiologische processen.

De bepaling van acute veranderingen in RBC-eiwitactiveringstoestanden brengt enkele methodologische uitdagingen met zich mee. De opslag van RBC-monsters voor latere analyse vereist bijvoorbeeld behoud van de gemodificeerde RBC-eiwitten, omdat posttranslationele modificaties niet duurzaam zijn. Bovendien zijn klassieke eiwitdetectiemethoden (bijv. Western blotting) notoir moeilijk te standaardiseren in RBC’s vanwege de lage overvloed aan eiwitten ten opzichte van hemoglobine, dat goed is voor ~ 98% van het eiwitgehalte in deze cellen¹². Op antilichamen gebaseerde kleuring van chemisch geconserveerde RBC’s is dus de voorkeursmethode geweest bij het onderzoeken van acute modificaties van belangrijke RBC-eiwitten, zoals de RBC-specifieke isovorm van stikstofmonoxidesynthase (RBC-NOS)^13,14. Van RBC-NOS is aangetoond dat het enzymatisch stikstofmonoxide (NO) produceert, wat onmisbaar lijkt voor essentiële RBC-eigenschappen, waaronder RBC-vervormbaarheid^15,16,17. Posttranslationele modificaties van RBC-NOS reguleren de katalytische enzymactiviteit, waarbij fosforylering van het serine 1177-residu wordt beschreven om de enzymactiviteit te verhogen, terwijl fosforylering van de residuen serine 114 of threonine 495 in verband is gebracht met verminderde RBC-NOS-activiteit^18,19.

Gezamenlijk dragen tijdelijke modificaties van RBC-eiwitten bij aan een belangrijke cellulaire functie en gestandaardiseerde protocollen die detectie van deze gemodificeerde eiwitten mogelijk maken, zijn van hoge waarde. Hier presenteren we twee verschillende protocollen die specifieke antilichamen gebruiken om de detectie van RBC-NOS-eiwitactivering te vergemakkelijken en bespreken we aanbevelingen voor gegevensanalyse en -interpretatie.

De prestaties van de beschreven protocollen werden beoordeeld door de goed gerapporteerde toename van de fosforylering van RBC-NOS bij het serine 1177-residu te meten als reactie op mechanische krachten die reflecteren op die welke optreden in de menselijke vasculatuur (5 Pa).