Détection basée sur l’immunomarquage d’altérations dynamiques dans les protéines des globules rouges
Summary
La capture des changements dynamiques dans l’activation protéique des globules rouges énucléés pose des défis méthodologiques, comme la préservation des changements dynamiques des stimuli aigus pour une évaluation ultérieure. Le protocole présenté décrit les techniques de préparation et de coloration des échantillons qui permettent la préservation et l’analyse des changements protéiques pertinents et la détection ultérieure.
Abstract
Le marquage des anticorps des protéines des globules rouges (GR) est une méthode semi-quantitative couramment utilisée pour détecter les changements dans la teneur globale en protéines ou les altérations aiguës des états d’activation des protéines. Il facilite l’évaluation des traitements des globules rouges, la caractérisation des différences dans certains états pathologiques et la description des cohérences cellulaires. La détection d’une altération aiguë de l’activation protéique (p. ex. par mécanotransduction) nécessite une préparation adéquate de l’échantillon pour préserver les modifications protéiques autrement temporaires. Le principe de base comprend l’immobilisation des sites de liaison cibles des protéines rouges souhaitées pour permettre la liaison initiale d’anticorps primaires spécifiques. L’échantillon est ensuite traité pour garantir des conditions optimales pour la liaison de l’anticorps secondaire à l’anticorps primaire correspondant. La sélection d’anticorps secondaires non fluorescents nécessite un traitement supplémentaire, y compris le couplage biotine-avidine et l’application de 3,3-diaminobenzidine-tétrachlorhydrate (DAB) pour développer la coloration, qui doit être contrôlée en temps réel au microscope afin d’arrêter l’oxydation, et donc l’intensité de la coloration, à temps. Pour la détection de l’intensité de la coloration, les images sont prises à l’aide d’un microscope optique standard. Dans une modification de ce protocole, un anticorps secondaire conjugué à la fluorescéine peut être appliqué à la place, ce qui présente l’avantage qu’aucune autre étape de développement n’est nécessaire. Cette procédure, cependant, nécessite un objectif de fluorescence attaché à un microscope pour la détection des colorations. Compte tenu de la nature semi-quantitative de ces méthodes, il est impératif de fournir plusieurs colorants de contrôle pour tenir compte des réactions d’anticorps non spécifiques et des signaux de fond. Ici, nous présentons à la fois les protocoles de coloration et les processus analytiques correspondants pour comparer et discuter des résultats et avantages respectifs des différentes techniques de coloration.
Introduction
Les globules rouges (GR) traversent le système cardiovasculaire pendant 70 à 140 jours, avec un âge moyen des globules rouges d’environ 115 jours 1,2. Les globules rouges sénescents ou endommagés sont éliminés de la circulation par érythrophagocytose, un processus d’élimination efficace entraîné par les macrophages3. La durée de vie prédéterminée de ces cellules est une conséquence de l’abandon des organites cellulaires, y compris le noyau, les mitochondries et les ribosomes, au cours de la différenciation et de la maturation4. Ainsi, les globules rouges circulants sont dépourvus de machinerie translationnelle, empêchant la synthèse de nouvelles protéines3. Il s’ensuit que les modifications dynamiques post-traductionnelles des protéines existantes représentent le seul mécanisme viable de régulation biochimique aiguë en réponse aux facteurs de stress extracellulaires et intracellulaires agissant sur les globules rouges5.
Les forces mécaniques semblent être les principaux indices extracellulaires qui provoquent l’activation ou la modulation des voies biochimiques dans les globules rouges. La découverte de la protéine mécanosensible, Piezo1, dans les membranes des globules rouges6 a inspiré plusieurs lignes de recherche sur la signalisation activée mécaniquement dans ces cellules7. Par exemple, des progrès récents ont montré que les propriétés physiques des globules rouges sont activement régulées par des changements aigus et dynamiques des protéines8, ce qui comprend la phosphorylation post-traductionnelle et l’ubiquitination9. Étant donné que ces modifications normales diffèrent dans certaines maladies 9,10,11, il semble être d’intérêt scientifique et clinique de déterminer l’état d’activation des protéines rouges, en particulier en relation avec les processus mécanobiologiques.
La détermination des changements aigus dans les états d’activation des protéines rouges pose certains défis méthodologiques. Par exemple, le stockage d’échantillons de globules rouges en vue d’une analyse ultérieure nécessite la préservation des protéines de globules rouges modifiées, car les modifications post-traductionnelles ne sont pas durables. De plus, les méthodes classiques de détection des protéines (par exemple, le transfert Western) sont notoirement difficiles à normaliser dans les globules rouges en raison de la faible abondance des protéines par rapport à l’hémoglobine, qui représente ~98% de la teneur en protéines de ces cellules12. Ainsi, la coloration par anticorps des globules rouges conservés chimiquement a été la méthode de choix pour étudier les modifications aiguës d’importantes protéines rouges, telles que l’isoforme spécifique des globules rouges de l’oxyde nitrique synthase (RBC-NOS)13,14. Il a été démontré que RBC-NOS produit de l’oxyde nitrique (NO) par voie enzymatique, ce qui semble indispensable pour les propriétés essentielles des globules rouges, y compris la déformabilité des globules rouges15,16,17. Les modifications post-traductionnelles de RBC-NOS régulent l’activité enzymatique catalytique, la phosphorylation du résidu de sérine 1177 étant décrite pour augmenter l’activité enzymatique, tandis que la phosphorylation des résidus sérine 114 ou thréonine 495 a été associée à une diminution de l’activité RBC-NOS18,19.
Collectivement, les modifications temporaires des protéines des globules rouges contribuent à une fonction cellulaire importante, et les protocoles normalisés qui permettent la détection de ces protéines modifiées sont d’une grande valeur. Ici, nous présentons deux protocoles distincts qui exploitent des anticorps spécifiques pour faciliter la détection de l’activation de la protéine RBC-NOS, et discutons des recommandations pour l’analyse et l’interprétation des données.
La performance des protocoles décrits a été évaluée en mesurant l’augmentation bien rapportée de la phosphorylation des globules rouges NOS au niveau du résidu de sérine 1177 en réponse à des forces mécaniques reflétant celles qui se produisent dans le système vasculaire humain (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
La littérature récente suggère fortement que la protéine RBC-NOS est d’une importance cruciale pour la régulation de la déformabilité des globules rouges 15,22,23, ce qui facilite leur passage à travers les capillaires étroits 24. L’activité protéique dépend fortement des modifications protéiques post-traductionnelles, en particulier de la phosphorylation de certains résidus<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK reconnaît le soutien d’une bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
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