Выявление динамических изменений белков эритроцитов с помощью иммуноокрашивания

Эритроциты (эритроциты) проходят через сердечно-сосудистую систему в течение 70-140 дней, при этом средний возраст эритроцитов составляет примерно 115 ^дней1,2. Стареющие или поврежденные эритроциты удаляются из кровотока с помощью эритрофагоцитоза, эффективного процесса очистки, управляемого макрофагами³. Предопределенная продолжительность жизни этих клеток является одним из следствий отказа клеточных органелл, включая ядро, митохондрии и рибосомы, во время дифференцировки и^{созревания.} Таким образом, циркулирующие эритроциты лишены трансляционного механизма, препятствующего синтезу новых белков³. Из этого следует, что динамические, посттрансляционные модификации существующих белков представляют собой единственный жизнеспособный механизм острой биохимической регуляции в ответ на внеклеточные и внутриклеточные стрессоры, действующие на эритроциты5.

Механические силы, по-видимому, являются основными внеклеточными сигналами, которые вызывают активацию или модуляцию биохимических путей в эритроцитах. Открытие механочувствительного белка Piezo1 в мембранах эритроцитов⁶ вдохновило несколько направлений исследований, изучающих механически активированную передачу сигналов в этих клетках⁷. Например, последние достижения показали, что физические свойства эритроцитов активно регулируются острыми и динамическими изменениями белков⁸, включая посттрансляционное фосфорилирование и убиквитинирование⁹. Поскольку эти нормальные модификации различаются при определенных заболеваниях 9,10,11, представляется научным и клиническим интересом определение состояния активации белков эритроцитов^, особенно в отношении механобиологических процессов.

Определение острых изменений состояний активации белка эритроцитов ставит ряд методологических задач. Например, хранение образцов эритроцитов для последующего анализа требует сохранения модифицированных белков эритроцитов, так как посттрансляционные модификации недолговечны. Более того, классические методы обнаружения белка (например, вестерн-блоттинг), как известно, трудно стандартизировать в эритроцитах из-за низкого содержания белков по отношению к гемоглобину, на долю которого приходится ~98% содержания белка в этих клетках¹². Таким образом, окрашивание химически консервированных эритроцитов на основе антител является методом выбора при исследовании острых модификаций важных белков эритроцитов, таких как эритро-специфическая изоформа синтазы оксида азота (RBC-NOS)^13,14. Было показано, что RBC-NOS ферментативно продуцирует оксид азота (NO), который, по-видимому, необходим для основных свойств эритроцитов, включая деформируемость эритроцитов^15,16,17. Посттрансляционные модификации RBC-NOS регулируют каталитическую активность фермента, при этом фосфорилирование остатка серина 1177 описано для увеличения активности фермента, в то время как фосфорилирование остатков серина 114 или треонина 495 было связано со снижением активности RBC-NOS^18,19.

В совокупности временные модификации белков эритроцитов вносят свой вклад в важную клеточную функцию, и стандартизированные протоколы, позволяющие обнаруживать эти модифицированные белки, имеют высокую ценность. В этой статье мы представим два различных протокола, которые используют специфические антитела для облегчения обнаружения активации белка RBC-NOS, и обсудим рекомендации по анализу и интерпретации данных.

Эффективность описанных протоколов оценивалась путем измерения хорошо зарегистрированного увеличения фосфорилирования RBC-NOS в остатке серина 1177 в ответ на механические силы, отражающие те, которые происходят в сосудистой сети человека (5 Па).