الكشف القائم على التلوين المناعي للتغيرات الديناميكية في بروتينات خلايا الدم الحمراء
Summary
يشكل التقاط التغيرات الديناميكية في تنشيط البروتين لخلايا الدم الحمراء المنزوعة النواة تحديات منهجية ، مثل الحفاظ على التغييرات الديناميكية للمنبهات الحادة لتقييمها لاحقا. يصف البروتوكول المقدم تقنيات تحضير العينات وتلطيخها التي تمكن من حفظ وتحليل تغيرات البروتين ذات الصلة والكشف اللاحق.
Abstract
يعد وضع علامات الأجسام المضادة لبروتينات خلايا الدم الحمراء (RBC) طريقة شبه كمية شائعة الاستخدام للكشف عن التغيرات في محتوى البروتين الكلي أو التغيرات الحادة في حالات تنشيط البروتين. يسهل تقييم علاجات كرات الدم الحمراء ، وتوصيف الاختلافات في حالات مرضية معينة ، ووصف التماسك الخلوي. يتطلب الكشف عن تنشيط البروتين المتغير بشكل حاد (على سبيل المثال ، من خلال النقل الميكانيكي) إعدادا كافيا للعينة للحفاظ على تعديلات البروتين المؤقتة. يتضمن المبدأ الأساسي شل حركة مواقع الربط المستهدفة لبروتينات كرات الدم الحمراء المرغوبة لتمكين الارتباط الأولي لأجسام مضادة أولية محددة. تتم معالجة العينة أيضا لضمان الظروف المثلى لربط الجسم المضاد الثانوي بالجسم المضاد الأولي المقابل. يتطلب اختيار الأجسام المضادة الثانوية غير الفلورية علاجا إضافيا ، بما في ذلك اقتران البيوتين-أفيدين وتطبيق 3،3-ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB) لتطوير التلوين ، والذي يجب التحكم فيه في الوقت الفعلي تحت المجهر من أجل وقف الأكسدة ، وبالتالي شدة التلوين ، في الوقت المحدد. للكشف عن شدة التلوين ، يتم التقاط الصور باستخدام مجهر ضوئي قياسي. في تعديل هذا البروتوكول ، يمكن تطبيق جسم مضاد ثانوي مقترن بالفلوريسئين بدلا من ذلك ، والذي يتميز بعدم الحاجة إلى مزيد من خطوات التطوير. ومع ذلك ، يتطلب هذا الإجراء هدفا مضانا متصلا بالمجهر للكشف عن التلطيخ. نظرا للطبيعة شبه الكمية لهذه الطرق ، من الضروري توفير العديد من بقع التحكم لحساب تفاعلات الأجسام المضادة غير المحددة وإشارات الخلفية. هنا ، نقدم كل من بروتوكولات التلوين والعمليات التحليلية المقابلة لمقارنة ومناقشة النتائج والمزايا الخاصة بتقنيات التلوين المختلفة.
Introduction
تجتاز خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) نظام القلب والأوعية الدموية لمدة 70 إلى 140 يوما ، بمتوسط عمر كرات الدم الحمراء حوالي 115 يوما 1,2. تتم إزالة كرات الدم الحمراء الهرمة أو التالفة من الدورة الدموية عن طريق كثرة البلعمة الحمراء ، وهي عملية تطهير فعالة مدفوعة بالبلاعم3. العمر المحدد مسبقا لهذه الخلايا هو أحد نتائج تسليم عضيات الخلية ، بما في ذلك النواة والميتوكوندريا والريبوسومات ، أثناء التمايز والنضج4. وبالتالي ، فإن كرات الدم الحمراء المتداولة خالية من آلية متعدية ، مما يحول دون تخليق بروتينات جديدة3. ويترتب على ذلك أن التعديلات الديناميكية اللاحقة للترجمة على البروتينات الموجودة تمثل الآلية الوحيدة القابلة للتطبيق للتنظيم الكيميائي الحيوي الحاد استجابة للضغوط خارج الخلية وداخل الخلايا التي تعمل على كرات الدمالحمراء 5.
يبدو أن القوى الميكانيكية هي إشارات رئيسية خارج الخلية تسبب تنشيط أو تعديل المسارات الكيميائية الحيوية داخل كرات الدم الحمراء. ألهم اكتشاف البروتين الحساس ميكانيكيا ، Piezo1 ، في أغشية كرات الدمالحمراء 6 عدة خطوط من الأبحاث التي تبحث في الإشارات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا في هذه الخلايا7. على سبيل المثال ، أظهرت التطورات الحديثة أن الخصائص الفيزيائية لكرات الدم الحمراء يتم تنظيمها بنشاط من خلال التغيرات الحادة والديناميكية للبروتينات8 ، والتي تشمل الفسفرة بعد الترجمة والوجود في كل مكان9. نظرا لأن هذه التعديلات الطبيعية تختلف في بعض الأمراض9،10،11 ، يبدو أنه من الأهمية العلمية والسريرية تحديد حالة تنشيط بروتينات كرات الدم الحمراء ، وتحديدا فيما يتعلق بالعمليات الميكانيكية البيولوجية.
يطرح تحديد التغيرات الحادة في حالات تنشيط بروتين كرات الدم الحمراء بعض التحديات المنهجية. على سبيل المثال ، يتطلب تخزين عينات كرات الدم الحمراء لتحليلها لاحقا الحفاظ على بروتينات كرات الدم الحمراء المعدلة ، حيث أن التعديلات اللاحقة للترجمة غير دائمة. علاوة على ذلك ، من المعروف أن طرق الكشف عن البروتين الكلاسيكية (على سبيل المثال ، النشاف الغربي) يصعب توحيدها في كرات الدم الحمراء بسبب انخفاض وفرة البروتينات بالنسبة للهيموجلوبين ، والذي يمثل ~ 98٪ من محتوى البروتين في هذه الخلايا12. وبالتالي ، كان التلوين القائم على الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء المحفوظة كيميائيا هو الطريقة المفضلة عند التحقيق في التعديلات الحادة لبروتينات كرات الدم الحمراء المهمة ، مثل الشكل المتماثل الخاص بكرات الدم الحمراء لسينسيز أكسيد النيتريك (RBC-NOS)13,14. لقد ثبت أن RBC-NOS ينتج أكسيد النيتريك (NO) إنزيميا ، والذي يبدو أنه لا غنى عنه لخصائص كرات الدم الحمراء الأساسية ، بما في ذلك تشوه كرات الدم الحمراء15،16،17. تنظم التعديلات اللاحقة للترجمة ل RBC-NOS نشاط الإنزيم التحفيزي ، مع وصف فسفرة بقايا سيرين 1177 لزيادة نشاط الإنزيم ، بينما تم ربط فسفرة بقايا سيرين 114 أو ثريونين 495 بانخفاض نشاط كرات الدم الحمراء18,19.
بشكل جماعي ، تساهم التعديلات المؤقتة لبروتينات كرات الدم الحمراء في وظيفة خلوية مهمة ، والبروتوكولات الموحدة التي تمكن من اكتشاف هذه البروتينات المعدلة ذات قيمة عالية. هنا ، نقدم بروتوكولين متميزين يستغلان أجساما مضادة محددة لتسهيل الكشف عن تنشيط بروتين RBC-NOS ، ونناقش توصيات لتحليل البيانات وتفسيرها.
تم تقييم أداء البروتوكولات الموصوفة من خلال قياس الزيادة المبلغ عنها جيدا في فسفرة كرات الدم الحمراء – NOS في بقايا سيرين 1177 استجابة للقوى الميكانيكية العاكسة لتلك التي تحدث داخل الأوعية الدموية البشرية (5 باسكال).
Protocol
Representative Results
Discussion
تشير الأدبيات الحديثة بشدة إلى أن بروتين RBC-NOS له أهمية حاسمة لتنظيم تشوه كرات الدم الحمراء15،22،23 ، والذي بدوره يسهل مرورها عبر الشعيرات الدمويةالضيقة 24. يعتمد نشاط البروتين بشكل كبير على تعديلات البروتين بعد الترجمة ، وخاصة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تقر LK بدعم منحة برنامج التدريب البحثي للحكومة الأسترالية.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
