Detecção de Alterações Dinâmicas em Proteínas Eritrocitárias Baseadas em Imunomarcação

As hemácias (hemácias) atravessam o sistema cardiovascular por 70 a 140 dias, com idade média das hemácias de aproximadamente 115 dias ^1,2. As hemácias senescentes ou lesadas são removidas da circulação por eritrofagocitose, um eficiente processo de clareamento conduzido por macrófagos³. O tempo de vida predeterminado dessas células é uma consequência da entrega das organelas celulares, incluindo o núcleo, as mitocôndrias e os ribossomos, durante a diferenciação e maturação⁴. Assim, as hemácias circulantes são desprovidas de maquinaria translacional, impossibilitando a síntese de novas proteínas³. Conclui-se que modificações dinâmicas e pós-traducionais em proteínas existentes representam o único mecanismo viável de regulação bioquímica aguda em resposta a estressores extracelulares e intracelulares que atuam sobre as hemácias⁵.

As forças mecânicas parecem ser as principais pistas extracelulares que causam a ativação ou modulação de vias bioquímicas dentro das hemácias. A descoberta da proteína mecanossensível, Piezo1, em membranas eritrocitárias6 inspirou várias linhas de pesquisa investigando a sinalização ativada mecanicamente nessas células⁷. Por exemplo, avanços recentes têm mostrado que as propriedades físicas das hemácias são ativamente reguladas por mudanças agudas e dinâmicas das proteínas⁸, o que inclui fosforilação pós-traducional e ubiquitinação⁹. Como essas modificações normais diferem em certas doenças 9,10,11, parece ser de interesse científico e clínico determinar o estado de ativação das proteínas eritrocitárias^, especificamente em relação aos processos mecanobiológicos.

A determinação de alterações agudas nos estados de ativação de proteínas eritrocitárias apresenta alguns desafios metodológicos. Por exemplo, o armazenamento de amostras de hemácias para análise posterior requer a preservação das proteínas eritrocitárias modificadas, uma vez que as modificações pós-traducionais não são duráveis. Além disso, os métodos clássicos de detecção de proteínas (por exemplo, western blotting) são notoriamente difíceis de padronizar em hemácias devido à baixa abundância de proteínas em relação à hemoglobina, que responde por ~98% do conteúdo proteico nessas células¹². Assim, a coloração de hemácias quimicamente preservadas com base em anticorpos tem sido o método de escolha na investigação de modificações agudas de importantes proteínas eritrocitárias, como a isoforma eritrocitária específica da óxido nítrico sintase (RBC-NOS)^13,14. Demonstrou-se que as hemácias-NOS produzem enzimaticamente óxido nítrico (NO), o que parece indispensável para propriedades essenciais das hemácias, incluindo a deformabilidade das hemácias^15,16,17. Modificações pós-traducionais de RBC-NOS regulam a atividade enzimática catalítica, com a fosforilação do resíduo de serina 1177 sendo descrita para aumentar a atividade enzimática, enquanto a fosforilação dos resíduos serina 114 ou treonina 495 tem sido associada à diminuição da atividade de RBC-NOS^18,19.

Coletivamente, modificações temporárias de proteínas eritrocitárias contribuem para importante função celular, e protocolos padronizados que permitem a detecção dessas proteínas modificadas são de alto valor. Aqui, apresentamos dois protocolos distintos que exploram anticorpos específicos para facilitar a detecção da ativação da proteína eritrocitária-NOS, e discutimos recomendações para análise e interpretação dos dados.

O desempenho dos protocolos descritos foi avaliado medindo-se o aumento bem relatado na fosforilação de eritrócitos-NOS no resíduo de serina 1177 em resposta a forças mecânicas reflexivas daquelas que ocorrem dentro da vasculatura humana (5 Pa).