赤血球タンパク質の動的変化の免疫染色ベースの検出

赤血球(RBC)は心血管系を70〜140日間横断し、平均赤血球年齢は約115日です^1,2。老化または損傷した赤血球は、マクロファージ³によって駆動される効率的な透明化プロセスである赤血球貪食によって循環から除去されます。これらの細胞の所定の寿命は、分化および成熟中に核、ミトコンドリア、およびリボソームを含む細胞小器官を放棄することの1つの結果である⁴。したがって、循環する赤血球は翻訳機構を欠いており、新しいタンパク質の合成を妨げています³。したがって、既存のタンパク質に対する動的な翻訳後修飾は、赤血球に作用する細胞外および細胞内ストレッサーに応答する急性の生化学的調節の唯一の実行可能なメカニズム^{を表しています5。}

機械的な力は、赤血球内の生化学的経路の活性化または調節を引き起こす主要な細胞外手がかりであるように思われます。赤血球膜⁶における機械感受性タンパク質Piezo1の発見は、これらの細胞における機械的に活性化されたシグナル伝達を調査するいくつかの研究ラインに影響を与えました⁷。例えば、最近の進歩により、赤血球の物理的特性は、翻訳後リン酸化やユビキ^{チン化を含むタンパク質8の}急性かつ動的な変化によって活発に制御されていることが示されています9。これらの正常な修飾は^{特定の疾患で}異なるため9,10,11、^特にメカノバイオロアプロセスに関連して、RBCタンパク質の活性化状態を決定することは科学的および臨床的に興味深いようです。

赤血球タンパク質活性化状態の急激な変化の決定は、いくつかの方法論的課題をもたらします。例えば、後の分析のために赤血球サンプルを保存するには、翻訳後修飾は耐久性がないため、修飾された赤血球タンパク質を保存する必要があります。さらに、従来のタンパク質検出法(ウェスタンブロッティングなど)は、これらの細胞のタンパク質含有量の~98%を占めるヘモグロビンに比べてタンパク質の存在量が少ないため、赤血球で標準化することが難しいことで有名です¹²。したがって、化学的に保存された赤血球の抗体ベースの染色は、一酸化窒素合成酵素の赤血球特異的アイソフォーム(RBC-NOS)などの重要な赤血球タンパク質の急性修飾を調べる際に選択される方法となっています^13,14。RBC-NOSは一酸化窒素(NO)を酵素的に生成することが示されており、これはRBC変形能を含む必須のRBC特性に不可欠であると思われる^15,16,17。RBC-NOSの翻訳後修飾は触媒酵素活性を調節し、セリン1177残基のリン酸化は酵素活性を増加させると記載されているが、セリン114またはスレオニン495残基のリン酸化はRBC-NOS活性の低下と関連している^18,19。

全体として、RBCタンパク質の一時的な修飾は重要な細胞機能に寄与し、これらの修飾タンパク質の検出を可能にする標準化されたプロトコルは高い価値があります。ここでは、RBC-NOSタンパク質活性化の検出を容易にするために特異的抗体を利用する2つの異なるプロトコルを提示し、データ分析と解釈のための推奨事項について説明します。

記載されたプロトコルの性能は、ヒト血管系内で起こるものを反映する機械的力(5Pa)に応答して、セリン1177残基におけるRBC−NOSのリン酸化のよく報告された増加を測定することによって評価した。