זיהוי מבוסס חיסונים של שינויים דינמיים בחלבוני תאי דם אדומים
Summary
לכידת שינויים דינמיים בהפעלת החלבונים של תאי דם אדומים מעוררים אתגרים מתודולוגיים, כמו שימור שינויים דינמיים לגירויים חריפים לצורך הערכה מאוחרת יותר. הפרוטוקול המוצג מתאר טכניקות הכנת דגימה וצביעה המאפשרות שימור וניתוח של שינויי חלבון רלוונטיים וזיהוי לאחר מכן.
Abstract
תיוג נוגדנים של חלבוני תאי דם אדומים (RBC) הוא שיטה נפוצה, כמותית למחצה, לזיהוי שינויים בתכולת החלבון הכוללת או שינויים חריפים במצבי הפעלת חלבון. זה מאפשר הערכה של טיפולי RBC, אפיון של הבדלים במצבי מחלה מסוימים, ותיאור של קוהרנטיות תאית. זיהוי של הפעלת חלבון שהשתנתה בחריפות (למשל, באמצעות מכנוטרנסדוקציה) דורש הכנת דגימה נאותה כדי לשמר שינויים זמניים בחלבון. העיקרון הבסיסי כולל השתקה של אתרי קשירת המטרה של חלבוני RBC הרצויים כדי לאפשר קשירה ראשונית של נוגדנים ראשוניים ספציפיים. הדגימה מעובדת עוד יותר כדי להבטיח תנאים אופטימליים לקשירת הנוגדן המשני לנוגדן הראשוני המתאים. בחירת נוגדנים משניים שאינם פלואורסצנטיים דורשת טיפול נוסף, כולל צימוד ביוטין-אבידין ויישום של 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) כדי לפתח את הצביעה, אשר צריך להיות נשלט בזמן אמת תחת מיקרוסקופ על מנת לעצור את החמצון, ובכך את עוצמת הצביעה, בזמן. לזיהוי עוצמת הצביעה, התמונות מצולמות באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי. בשינוי של פרוטוקול זה, נוגדן משני מצומד פלואורסצאין יכול להיות מיושם במקום, אשר יש את היתרון כי אין צורך בשלב פיתוח נוסף. הליך זה, לעומת זאת, דורש מטרת פלואורסצנטיות המחוברת למיקרוסקופ לזיהוי כתמים. בהתחשב באופי הכמותי למחצה של שיטות אלה, הכרחי לספק מספר כתמי בקרה כדי להסביר תגובות נוגדנים לא ספציפיות ואותות רקע. כאן, אנו מציגים הן פרוטוקולי צביעה והן את התהליכים האנליטיים המתאימים כדי להשוות ולדון בתוצאות וביתרונות בהתאמה של טכניקות הצביעה השונות.
Introduction
תאי דם אדומים (RBCs) חוצים את מערכת הלב וכלי הדם במשך 70 עד 140 ימים, עם גיל RBC ממוצע של כ -115 ימים 1,2. RBCs מזדקנים או פגומים מוסרים ממחזור הדם על ידי אריתרופאגוציטוזה, תהליך ניקוי יעיל המונע על ידי מקרופאגים3. תוחלת החיים שנקבעה מראש של תאים אלה היא אחת התוצאות של ויתור על אברוני התא, כולל הגרעין, המיטוכונדריה והריבוזומים, במהלך התמיינות והבשלה4. לפיכך, RBCs במחזור נטולי מנגנון תרגומי, המונע סינתזה של חלבונים חדשים3. מכאן נובע כי שינויים דינמיים לאחר תרגום חלבונים קיימים מייצגים את המנגנון המעשי היחיד של ויסות ביוכימי חריף בתגובה לגורמי עקה חוץ-תאיים ותוך-תאיים הפועלים על RBCs5.
נראה כי כוחות מכניים הם רמזים חוץ-תאיים עיקריים הגורמים להפעלה או אפנון של מסלולים ביוכימיים בתוך RBCs. גילוי החלבון הרגיש למכנו, Piezo1, בקרומי RBC6 נתן השראה למספר קווי מחקר שחקרו איתות המופעל מכנית בתאים אלה7. לדוגמה, ההתקדמות האחרונה הראתה כי התכונות הפיזיקליות של RBCs מווסתות באופן פעיל על ידי שינויים חריפים ודינמיים של חלבונים8, הכולל זרחן לאחר תרגום ויוביקוויטינציה9. מכיוון ששינויים נורמליים אלה שונים במחלות מסוימות 9,10,11, נראה שיש עניין מדעי וקליני לקבוע את מצב ההפעלה של חלבוני RBC, במיוחד ביחס לתהליכים מכנוביולוגיים.
קביעת שינויים חריפים במצבי הפעלת חלבון RBC מציבה כמה אתגרים מתודולוגיים. לדוגמה, אחסון דגימות RBC לניתוח מאוחר יותר דורש שימור של חלבוני RBC שעברו שינוי, מכיוון ששינויים לאחר תרגום אינם עמידים. יתר על כן, שיטות קלאסיות לזיהוי חלבונים (למשל, כתם מערבי) ידועות לשמצה כקשות לסטנדרטיזציה ב- RBCs בשל השפע הנמוך של חלבונים ביחס להמוגלובין, המהווה ~98% מתכולת החלבון בתאים אלה12. לפיכך, צביעה מבוססת נוגדנים של RBCs שהשתמרו כימית הייתה השיטה המועדפת בעת חקירת שינויים חריפים של חלבוני RBC חשובים, כגון איזופורם ספציפי ל-RBC של סינתאז תחמוצת החנקן (RBC-NOS)13,14. הוכח כי RBC-NOS מייצר באופן אנזימטי תחמוצת החנקן (NO), שנראה חיוני לתכונות RBC חיוניות, כולל עיוות RBC15,16,17. שינויים לאחר תרגום של RBC-NOS מווסתים את פעילות האנזים הקטליטי, כאשר זרחן של שאריות סרין 1177 מתואר כמגביר את פעילות האנזים, בעוד זרחן של שאריות סרין 114 או תראונין 495 נקשרו לירידה בפעילות RBC-NOS18,19.
באופן קולקטיבי, שינויים זמניים של חלבוני RBC תורמים לתפקוד תאי חשוב, ופרוטוקולים סטנדרטיים המאפשרים זיהוי של חלבונים מהונדסים אלה הם בעלי ערך גבוה. כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים נפרדים המנצלים נוגדנים ספציפיים כדי להקל על זיהוי הפעלת חלבון RBC-NOS, ודנים בהמלצות לניתוח נתונים ופענוח.
הביצועים של הפרוטוקולים המתוארים הוערכו על ידי מדידת העלייה המדווחת היטב בזרחון של RBC-NOS בשאריות סרין 1177 בתגובה לכוחות מכניים המשקפים את אלה המתרחשים בתוך כלי הדם האנושיים (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
ספרות עדכנית מצביעה על כך שלחלבון RBC-NOS יש חשיבות מכרעת לוויסות עיוות RBC 15,22,23, שבתורו מקל על המעבר שלהם דרך נימים צרים 24. פעילות החלבונים תלויה מאוד בשינויים חלבוניים לאחר התרגום, במיוחד הזרחן של שאריות מסוימות18. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK מודה בתמיכתה של מלגת תוכנית הכשרת המחקר של ממשלת אוסטרליה.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
