Kırmızı Kan Hücresi Proteinlerinde Dinamik Değişikliklerin İmmün Boyama Tabanlı Tespiti
Summary
Enükleasyonlu kırmızı kan hücrelerinin protein aktivasyonundaki dinamik değişiklikleri yakalamak, daha sonra değerlendirilmek üzere akut uyaranlardaki dinamik değişikliklerin korunması gibi metodolojik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Sunulan protokol, ilgili protein değişikliklerinin korunmasını ve analizini ve müteakip tespitini sağlayan numune hazırlama ve boyama tekniklerini açıklar.
Abstract
Kırmızı kan hücresi (RBC) proteinlerinin antikor etiketlemesi, genel protein içeriğindeki değişiklikleri veya protein aktivasyon durumlarındaki akut değişiklikleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılan, yarı kantitatif bir yöntemdir. RBC tedavilerinin değerlendirilmesini, belirli hastalık durumlarındaki farklılıkların karakterizasyonunu ve hücresel tutarlılıkların tanımlanmasını kolaylaştırır. Akut olarak değiştirilmiş protein aktivasyonunun tespiti (örneğin, mekanotransdüksiyon yoluyla), aksi takdirde geçici protein modifikasyonlarını korumak için yeterli numune hazırlığı gerektirir. Temel prensip, spesifik primer antikorların ilk bağlanmasını sağlamak için istenen RBC proteinlerinin hedef bağlanma bölgelerinin hareketsiz hale getirilmesini içerir. Numune, ikincil antikorun karşılık gelen birincil antikora bağlanması için en uygun koşulları garanti etmek için daha fazla işlenir. Floresan olmayan ikincil antikorların seçimi, oksidasyonu durdurmak için mikroskop altında gerçek zamanlı olarak kontrol edilmesi gereken boyamayı geliştirmek için biyotin-avidin eşleşmesi ve 3,3-diaminobenzidin-tetrahidroklorür (DAB) uygulaması dahil olmak üzere ek tedavi gerektirir. Boyama yoğunluğu tespiti için görüntüler standart bir ışık mikroskobu kullanılarak alınır. Bu protokolün bir modifikasyonunda, bunun yerine floresein ile konjuge bir ikincil antikor uygulanabilir, bu da daha fazla geliştirme adımına gerek olmaması avantajına sahiptir. Bununla birlikte, bu prosedür, boyama tespiti için bir mikroskoba bağlı bir floresan objektif gerektirir. Bu yöntemlerin yarı kantitatif doğası göz önüne alındığında, spesifik olmayan antikor reaksiyonlarını ve arka plan sinyallerini hesaba katmak için birkaç kontrol boyası sağlamak zorunludur. Burada, farklı boyama tekniklerinin ilgili sonuçlarını ve avantajlarını karşılaştırmak ve tartışmak için hem boyama protokollerini hem de ilgili analitik süreçleri sunuyoruz.
Introduction
Kırmızı kan hücreleri (RBC’ler) kardiyovasküler sistemi 70 ila 140 gün boyunca geçer ve ortalama RBC yaşı yaklaşık 115 gündür 1,2. Yaşlanan veya hasar görmüş eritrositler, makrofajlar tarafından yönlendirilen etkili bir temizleme işlemi olan eritrofagositoz ile dolaşımdan çıkarılır3. Bu hücrelerin önceden belirlenmiş ömrü, farklılaşma ve olgunlaşma sırasında çekirdek, mitokondri ve ribozomlar dahil olmak üzere hücre organellerinin teslim edilmesinin bir sonucudur4. Bu nedenle, dolaşımdaki RBC’ler, yeni proteinlerinsentezini engelleyen bir translasyon makinesinden yoksundur 3. Mevcut proteinlere yapılan dinamik, translasyon sonrası modifikasyonların, RBC’lere etki eden hücre dışı ve hücre içi stresörlere yanıt olarak akut, biyokimyasal düzenlemenin tek uygulanabilir mekanizmasını temsil ettiği sonucuçıkar 5.
Mekanik kuvvetler, RBC’ler içindeki biyokimyasal yolların aktivasyonuna veya modülasyonuna neden olan başlıca hücre dışı ipuçları gibi görünmektedir. RBC membranlarında6 mekanosensitif protein olan Piezo1’in keşfi, bu hücrelerde mekanik olarak aktive edilen sinyalleri araştıran birkaç araştırma hattına ilham verdi7. Örneğin, son gelişmeler, RBC’lerin fiziksel özelliklerinin, translasyon sonrası fosforilasyon ve ubikitinasyon9 içeren proteinlerin8 akut ve dinamik değişiklikleri tarafından aktif olarak düzenlendiğini göstermiştir. Bu normal modifikasyonlar bazı hastalıklarda farklılık gösterdiğinden9,10,11, özellikle mekanobiyolojik süreçlerle ilgili olarak RBC proteinlerinin aktivasyon durumunu belirlemek bilimsel ve klinik açıdan ilgi çekici görünmektedir.
RBC protein aktivasyon durumlarındaki akut değişikliklerin belirlenmesi bazı metodolojik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, RBC numunelerinin daha sonraki analizler için saklanması, translasyon sonrası modifikasyonlar dayanıklı olmadığından, modifiye edilmiş RBC proteinlerinin korunmasını gerektirir. Ayrıca, klasik protein tespit yöntemlerinin (örneğin, western blotting), bu hücrelerdeki protein içeriğinin ~% 98’ini oluşturan hemoglobine göre düşük protein bolluğu nedeniyle RBC’lerde standardize edilmesi çok zordur12. Bu nedenle, nitrik oksit sentazın RBC’ye özgü izoformu (RBC-NOS)13,14 gibi önemli RBC proteinlerinin akut modifikasyonlarını araştırırken, kimyasal olarak korunmuş RBC’lerin antikor bazlı boyanması tercih edilen yöntem olmuştur. RBC-NOS’un, RBC deforme olabilirliği15,16,17 dahil olmak üzere temel RBC özellikleri için vazgeçilmez görünen nitrik oksit (NO) enzimatik olarak ürettiği gösterilmiştir. RBC-NOS’un translasyon sonrası modifikasyonları, katalitik enzim aktivitesini düzenler, serin 1177 kalıntısının fosforilasyonu enzim aktivitesini arttırmak için tarif edilirken, serin 114 veya treonin 495 kalıntılarının fosforilasyonu, azalmış RBC-NOS aktivitesi18,19 ile ilişkilendirilmiştir.
Toplu olarak, RBC proteinlerinin geçici modifikasyonları önemli hücresel fonksiyona katkıda bulunur ve bu modifiye proteinlerin saptanmasını sağlayan standartlaştırılmış protokoller yüksek değere sahiptir. Burada, RBC-NOS protein aktivasyonunun saptanmasını kolaylaştırmak için spesifik antikorlardan yararlanan iki farklı protokol sunuyoruz ve veri analizi ve yorumlanması için önerileri tartışıyoruz.
Açıklanan protokollerin performansı, insan damar sistemi (5 Pa) içinde meydana gelenleri yansıtan mekanik kuvvetlere yanıt olarak serin 1177 kalıntısında RBC-NOS’un fosforilasyonunda iyi bildirilen artış ölçülerek değerlendirildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son literatür, RBC-NOS proteininin, RBC deforme olabilirliğinin 15,22,23 düzenlenmesi için çok önemli olduğunu ve bunun da dar kılcal damarlardan geçişlerini kolaylaştırdığınıgöstermektedir 24. Protein aktivitesi büyük ölçüde translasyon sonrası protein modifikasyonlarına, özellikle belirli kalıntılarınfosforilasyonuna bağlıdır 18. İlgi odağı, RBC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK, Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Bursunun desteğini kabul eder.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
