Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

As células beta pancreáticas secretam insulina respondendo a aumentos nos níveis de glicose no sangue. Pacientes sem produção suficiente de insulina devido à destruição autoimune das células beta no diabetes tipo 1 (DM1)¹, ou devido à disfunção das células beta no diabetes tipo 2 (DM2)², são tipicamente tratados com a administração de insulina exógena. Apesar dessa terapia que salva vidas, ela não pode corresponder precisamente ao controle requintado da glicose no sangue, como alcançado pela secreção dinâmica de insulina das células beta de boa-fé. Como tal, os pacientes frequentemente sofrem as consequências de episódios hipoglicêmicos com risco de vida e outras complicações resultantes de excursões hiperglicêmicas crônicas. O transplante de ilhotas de cadáveres humanos restaura com sucesso o controle glicêmico rigoroso em pacientes com DM1, mas é limitado pela disponibilidade de ilhotas doadoras e dificuldades na purificação de ilhotas saudáveis para transplante ^3,4. Este desafio pode, em princípio, ser resolvido com o uso de hPSCs como material de partida alternativo.

As estratégias atuais de geração de ilhotas secretoras de insulina a partir de hPSCs in vitro frequentemente visam mimetizar o processo de desenvolvimento do pâncreas embrionário in vivo ^5,6. Isso requer conhecimento das vias de sinalização responsáveis e adição cronometrada de fatores solúveis correspondentes para mimetizar estágios críticos do pâncreas embrionário em desenvolvimento. O programa pancreático inicia-se com o comprometimento na endoderme definitiva, que é marcada pelos fatores de transcrição forkhead box A2 (FOXA2) e região determinante do sexo Y-box 17 (SOX17)⁷. A diferenciação sucessiva da endoderme definitiva envolve a formação de um tubo intestinal primitivo, padronizado em um intestino anterior posterior que expressa a homeocaixa 1 pancreática e duodenal (PDX1)^7,8,9, e expansão epitelial em progenitores pancreáticos que co-expressam PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)^10,11.

Um maior comprometimento com as células das ilhotas endócrinas é acompanhado pela expressão transitória do regulador mestre pró-endócrino neurogenina-3 (NGN3)12 e indução estável dos principais fatores de transcrição diferenciação neuronal 1 (NEUROD1) e NK2 homeobox 2 (^NKX2.2)¹³. As principais células que expressam hormônios, como células beta produtoras de insulina, células alfa produtoras de glucagon, células delta produtoras de somatostatina e células PPY produtoras de polipeptídeos pancreáticos, são subsequentemente programadas. Com esse conhecimento, bem como descobertas de extensos estudos de triagem de drogas em alto rendimento, avanços recentes têm possibilitado a geração de ilhotas hPSC com células semelhantes às células beta capazes de secreção de insulina 14,15,16,17,18,19.

Protocolos step-wise têm sido relatados para gerar células beta responsivas à glicose 6,14,18,19. Com base nesses estudos, o presente protocolo envolve o uso de um kit de progenitores pancreáticos para gerar células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1⁺ em uma cultura plana, seguido pela agregação da placa de micropoços em agrupamentos de tamanho uniforme e diferenciação adicional para ilhotas hPSC secretoras de insulina com o protocolo R em uma cultura de suspensão 3D estática. Análises de controle de qualidade, incluindo citometria de fluxo, imunomarcação e avaliação funcional, são realizadas para caracterização rigorosa das células diferenciadoras. Este trabalho fornece uma descrição detalhada de cada etapa da diferenciação dirigida e delineia as abordagens de caracterização in vitro.