Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Le cellule beta pancreatiche secernono insulina rispondendo all’aumento dei livelli di glucosio nel sangue. I pazienti che non hanno una produzione sufficiente di insulina a causa della distruzione autoimmune delle cellule beta nel diabete di tipo 1 (T1D)¹, o a causa della disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 (T2D)², sono in genere trattati con la somministrazione di insulina esogena. Nonostante questa terapia salvavita, non può eguagliare con precisione lo squisito controllo della glicemia ottenuto dalla secrezione dinamica di insulina dalle cellule beta in buona fede. Pertanto, i pazienti spesso subiscono le conseguenze di episodi ipoglicemici potenzialmente letali e altre complicanze derivanti da escursioni iperglicemice croniche. Il trapianto di isole da cadavere umano ripristina con successo uno stretto controllo glicemico nei pazienti con diabete di tipo 1, ma è limitato dalla disponibilità di donatori di isole e dalle difficoltà nel purificare le isole sane per il trapianto ^3,4. Questa sfida può, in linea di principio, essere risolta utilizzando le hPSC come materiale di partenza alternativo.

Le attuali strategie per la generazione di isole che secernono insulina da hPSC in vitro spesso mirano a imitare il processo di sviluppo del pancreas embrionale in vivo ^5,6. Ciò richiede la conoscenza delle vie di segnalazione responsabili e l’aggiunta temporizzata di fattori solubili corrispondenti per imitare le fasi critiche del pancreas embrionale in via di sviluppo. Il programma pancreatico inizia con l’impegno nell’endoderma definitivo, che è caratterizzato dai fattori di trascrizione forkhead box A2 (FOXA2) e dalla regione Y-box 17 che determina il sesso (SOX17)⁷. La differenziazione successiva dell’endoderma definitivo comporta la formazione di un tubo intestinale primitivo, che si sviluppa in un intestino anteriore posteriore che esprime l’omeobox pancreatico e duodenale 1 (PDX1)^7,8,9 e l’espansione epiteliale nei progenitori pancreatici che co-esprimono PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)^10,11.

Un ulteriore impegno per le cellule delle isole endocrine è accompagnato dall’espressione transitoria della neurogenina-3 (NGN3)12 e dall’induzione stabile dei fattori di trascrizione chiave della differenziazione neuronale 1 (NEUROD1) e dell’homeobox 2 NK2 (^NKX2.2)¹³. Le principali cellule che esprimono ormoni, come le cellule beta produttrici di insulina, le cellule alfa produttrici di glucagone, le cellule delta produttrici di somatostatina e le cellule PPY produttrici di polipeptidi pancreatici, vengono successivamente programmate. Con questa conoscenza, così come le scoperte di studi di screening farmacologico estesi e ad alto rendimento, i recenti progressi hanno permesso la generazione di isole hPSC con cellule simili alle cellule beta in grado di secernere insulina 14,15,16,17,18,19.

Sono stati riportati protocolli graduali per la generazione di cellule beta^sensibili al glucosio 6,14,18,19. Sulla base di questi studi, il presente protocollo prevede l’uso di un kit di progenitori pancreatici per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche PDX1+/NKX6.1⁺ in una coltura planare, seguita dall’aggregazione di piastre a micropozzetti in cluster di dimensioni uniformi e da un’ulteriore differenziazione verso le isole hPSC secernenti insulina con il protocollo R in una coltura statica in sospensione 3D. Vengono eseguite analisi di controllo della qualità, tra cui citometria a flusso, immunocolorazione e valutazione funzionale, per una rigorosa caratterizzazione delle cellule differenzianti. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di ogni fase del differenziamento diretto e delinea gli approcci di caratterizzazione in vitro.