ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化
Summary
幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。
Abstract
ヒト多能性幹細胞(hPS細胞)からインスリン分泌型ベータ細胞への分化は、ベータ細胞の機能や糖尿病治療の研究材料となります。しかし、天然のヒトベータ細胞を適切に模倣した幹細胞由来のベータ細胞を得るには課題が残っています。これまでの研究に基づいて、hPS細胞由来の膵島細胞を作製し、分化の結果と一貫性を改善したプロトコールを作成しました。ここで説明するプロトコルは、ステージ1〜4で膵臓前駆細胞キットを使用し、その後、ステージ5〜7で2014年に以前に発表された論文(以下「Rプロトコル」と呼ぶ)から変更されたプロトコルを使用します。膵臓前駆細胞キットと直径400 μmのマイクロウェルプレートを使用して膵臓前駆細胞クラスターを作製するための詳細な手順、96ウェル静的懸濁液フォーマットでの内分泌分化のためのRプロトコル、およびhPS細胞由来膵島の in vitro 特性評価と機能評価が含まれています。完全なプロトコルでは、最初のhPS細胞増殖に1週間かかり、その後、インスリン産生hPS細胞膵島を得るのに~5週間かかります。基本的な幹細胞培養技術と生物学的アッセイのトレーニングを受けた担当者は、このプロトコルを再現できます。
Introduction
膵臓のベータ細胞は、血糖値の上昇に反応してインスリンを分泌します。1型糖尿病(T1D)1におけるベータ細胞の自己免疫破壊、または2型糖尿病(T2D)2におけるベータ細胞機能障害により、十分なインスリン産生が欠如している患者は、通常、外因性インスリンの投与で治療される。この命を救う治療法にもかかわらず、正真正銘のベータ細胞からの動的なインスリン分泌によって達成される血糖値の絶妙なコントロールに正確に匹敵するものではありません。そのため、患者はしばしば生命を脅かす低血糖エピソードや慢性高血糖エクスカーションに起因する他の合併症の結果に苦しむ。ヒト死体膵島の移植は、T1D患者の厳密な血糖コントロールを正常に回復させますが、膵島ドナーの利用可能性と移植のための健康な膵島の浄化の難しさによって制限されます3,4。この課題は、原理的には、ヒトPS細胞を代替出発物質として使用することで解決できます。
in vitroでヒトPS細胞からインスリン分泌膵島を作製する現在の戦略は、in vivoでの膵臓胚発生の過程を模倣することを目的としていることが多い5,6。これには、発生中の胚性膵臓の重要な段階を模倣するために、責任あるシグナル伝達経路に関する知識と、対応する可溶性因子のタイムリーな追加が必要です。膵臓プログラムは、転写因子フォークヘッドボックスA2(FOXA2)と性決定領域Yボックス17(SOX17)7によって特徴付けられる決定的な内胚葉へのコミットメントから始まります。決定的な内胚葉の逐次分化には、原始的な腸管の形成、膵臓および十二指腸のホメオボックス1(PDX1)7,8,9を発現する後部前腸へのパターン形成、およびPDX1とNK6ホメオボックス1(NKX6.1)10,11を共発現する膵前駆細胞への上皮拡張が含まれます。
内分泌膵島細胞へのさらなる関与は、内分泌促進性マスターレギュレーターニューロゲニン-3(NGN3)12の一過性発現と、主要な転写因子であるニューロン分化1(NEUROD1)およびNK2ホメオボックス2(NKX2.2)13の安定的な誘導を伴います。その後、インスリン産生ベータ細胞、グルカゴン産生アルファ細胞、ソマトスタチン産生デルタ細胞、および膵臓ポリペプチド産生PPY細胞などの主要なホルモン発現細胞をプログラムする。この知識と、広範でハイスループットな薬物スクリーニング研究からの発見により、最近の進歩により、インスリン分泌が可能なベータ細胞に似た細胞を持つhPS細胞の作製が可能になりました14,15,16,17,18,19。
段階的なプロトコルはブドウ糖敏感なベータ細胞6,14,18,19を発生させるために報告されている。これらの研究に基づいて構築された、現在のプロトコルには、平面培養でPDX1 + / NKX6.1+膵臓前駆細胞を生成するための膵臓前駆細胞キットの使用が含まれ、続いてマイクロウェルプレートを均一なサイズのクラスターに凝集し、静的3D懸濁培養でRプロトコルを使用してインスリン分泌hPSC膵島をさらに分化します。フローサイトメトリー、免疫染色、機能評価などの品質管理分析は、分化細胞の厳密な特性評価のために実施されます。このホワイトペーパーでは、指向性分化の各ステップを詳細に説明し、in vitro 特性評価アプローチの概要を説明します。
Protocol
このプロトコルは、H1、HUES4 PDXeG、Mel1 INSGFP/WなどのhPSC株をフィーダーフリー条件で使用することに基づいています。このセクションでは、ステップバイステップの手順を詳しく説明し、代表的な結果のセクションにMel1 INSGFP/W の分化からの裏付けデータを示します。ここに記載されていない他のhPSC株を扱う場合は、さらなる最適化が必要であることを推奨します。このプロト…
Representative Results
幹細胞をインスリン分泌性hPS細胞膵島に7つのステップで分化させるハイブリッド戦略を開発し、平面培養の最初の4段階では膵臓前駆細胞キットを使用し、最後の3段階では静的浮遊培養で以前に報告された方法6に基づいて構築された修正プロトコルを使用します(図1).このプロトコルでは、細胞播種後24時間(ステージ0)でほぼコンフルエント(90%-100%)の?…
Discussion
この論文では、in vitroで培養してから40日以内に、グルコースチャレンジでインスリンを分泌できるhPS細胞膵島を作製できる7段階のハイブリッドプロトコルについて説明します。これらの複数のステップの中で、決定的な内胚葉の効率的な誘導は、最終的な分化の結果のための重要な出発点を設定すると考えられています18,27,28<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、Stem Cell Network、JDRF、Canadian Institutes of Health Researchからの支援に感謝します。Jia ZhaoとShenghui Liangは、Michael Smith Health Research BC Trainee Awardを受賞しました。Mitchell J.S. Braamは、Mitacs Accelerate Fellowshipの受賞者です。Diepiriye G. Iworimaは、Alexander Graham Bell Canada Graduate ScholarshipとCFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Awardを受賞しています。MCRIとモナシュ大学のEdouard G. Stanley博士には、Mel1 INS GFP/W ラインを共有し、アルバータ糖尿病研究所の膵島コアには、ヒト膵島を分離して配布してくださったことに心から感謝します。また、ブリティッシュコロンビア大学のライフサイエンスインスティテュートイメージングおよびフローサイトメトリー施設からの支援にも感謝しています。 図 1 は BioRender.com で作成されました。
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
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Tags
Human Pluripotent Stem CellsInsulin-producing Islet ClustersStatic Suspension CulturePancreatic ProgenitorsIslet-like ClustersHESC-qualified MatrigelCell DissociationStem Cell CultureStage 1A MediumStage 1B MediumStage 2A MediumStage 2B MediumStage 3 MediumStage 4 MediumAnti-adherence Rinsing SolutionMicrowell Plate
Cite This Article
Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J. S., Baker, R. K., Iworima, D. G., Quiskamp, N., Kieffer, T. J. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters. J. Vis. Exp. (196), e64840, doi:10.3791/64840 (2023).