Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в инсулин-продуцирующие островковые кластеры
Summary
Дифференцировка стволовых клеток в островковые клетки представляет собой альтернативное решение по сравнению с традиционным лечением диабета и моделированием заболевания. Мы описываем подробный протокол культивирования стволовых клеток, который сочетает в себе коммерческий набор для дифференцировки с ранее проверенным методом, помогающим в производстве инсулинсекретирующих островков, полученных из стволовых клеток, в чашке.
Abstract
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) в инсулинсекретирующие бета-клетки дает материал для изучения функции бета-клеток и лечения диабета. Тем не менее, остаются проблемы с получением бета-клеток, полученных из стволовых клеток, которые адекватно имитируют нативные бета-клетки человека. Основываясь на предыдущих исследованиях, островковые клетки, полученные из чПСК, были созданы для создания протокола с улучшенными результатами дифференцировки и согласованностью. Протокол, описанный здесь, использует набор предшественников поджелудочной железы на стадиях 1-4, а затем протокол, модифицированный на основе статьи, ранее опубликованной в 2014 году (далее именуемый «R-протокол») на стадиях 5-7. Включены подробные процедуры использования набора панкреатического предшественника и микролуночных планшетов диаметром 400 мкм для создания кластеров-предшественников поджелудочной железы, R-протокол для эндокринной дифференцировки в формате статической суспензии 96 лунок, а также характеристика in vitro и функциональная оценка островков, полученных из чПСК. Полный протокол занимает 1 неделю для первоначальной экспансии hPSC, а затем ~5 недель для получения инсулин-продуцирующих островков hPSC. Персонал, владеющий базовыми методами культивирования стволовых клеток и обученный биологическим анализам, может воспроизвести этот протокол.
Introduction
Бета-клетки поджелудочной железы секретируют инсулин в ответ на повышение уровня глюкозы в крови. Пациентов, у которых отсутствует достаточная выработка инсулина из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток при диабете 1 типа (СД1)1 или из-за дисфункции бета-клеток при диабете 2 типа (СД2)2, обычно лечат введением экзогенного инсулина. Несмотря на эту жизненно важную терапию, она не может в точности сравниться с точным контролем уровня глюкозы в крови, который достигается за счет динамической секреции инсулина из настоящих бета-клеток. Таким образом, пациенты часто страдают от последствий опасных для жизни эпизодов гипогликемии и других осложнений, возникающих в результате хронических гипергликемических экскурсий. Трансплантация трупных островков человека успешно восстанавливает жесткий гликемический контроль у пациентов с СД1, но ограничена доступностью островковых доноров и трудностями в очистке здоровых островков для трансплантации 3,4. Эта проблема, в принципе, может быть решена путем использования ПСК в качестве альтернативного исходного материала.
Современные стратегии получения инсулинсекретирующих островков из ПСК in vitro часто направлены на имитацию процесса развития эмбриональной поджелудочной железы in vivo 5,6. Это требует знания ответственных сигнальных путей и своевременного добавления соответствующих растворимых факторов для имитации критических стадий развития эмбриональной поджелудочной железы. Программа поджелудочной железы начинается с вовлечения в дефинитивную энтодерму, которая отмечена транскрипционными факторами вилочной головки A2 (FOXA2) и определяющей пол областью Y-box 17 (SOX17)7. Последовательная дифференцировка дефинитивной энтодермы включает в себя формирование примитивной кишечной трубки, переходящей в заднюю переднюю кишку, которая экспрессирует гомеобокс поджелудочной и двенадцатиперстной кишки 1 (PDX1)7,8,9, и эпителиальную экспансию в предшественники поджелудочной железы, которые совместно экспрессируют гомеобокс PDX1 и гомеобокс 1 NK6 (NKX6.1)10,11.
Дальнейшая приверженность эндокринным островковым клеткам сопровождается транзиторной экспрессией главного проэндокринного регулятора нейрогенина-3 (NGN3)12 и стабильной индукцией ключевых транскрипционных факторов дифференцировки нейронов 1 (NEUROD1) и гомеобокса 2 NK2 (NKX2.2)13. Основные гормоноэкспрессирующие клетки, такие как инсулин-продуцирующие бета-клетки, глюкагон-продуцирующие альфа-клетки, соматостатин-продуцирующие дельта-клетки и полипептид-продуцирующие ППИ поджелудочной железы, впоследствии программируются. Благодаря этим знаниям, а также открытиям, сделанным в ходе обширных высокопроизводительных скрининговых исследований лекарственных средств, недавние достижения позволили создать hPSC-островки с клетками, напоминающими бета-клетки, способные секрецию инсулина 14,15,16,17,18,19.
Сообщалось о пошаговых протоколах генерации глюкозочувствительных бета-клеток 6,14,18,19. Основанный на этих исследованиях, настоящий протокол включает в себя использование набора панкреатических предшественников для получения клеток-предшественников поджелудочной железы PDX1+/NKX6.1+ в планарной культуре с последующей агрегацией микролуночных пластин в кластеры однородного размера и дальнейшей дифференцировкой в сторону инсулинсекретирующих hPSC-островков с помощью R-протокола в статической 3D-культуре суспензии. Контрольный анализ качества, включая проточную цитометрию, иммуноокрашивание и функциональную оценку, выполняется для точной характеристики дифференцирующих клеток. В данной работе подробно описан каждый этап направленной дифференциации и описаны подходы к характеризации in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается семиступенчатый гибридный протокол, который позволяет генерировать островки hPSC, способные секретировать инсулин при глюкозном исследовании в течение 40 дней культивирования in vitro. Считается, что среди этих многочисленных этапов эффективная индукция око?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность за поддержку со стороны компаний STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF и Канадского института исследований в области здравоохранения. Цзя Чжао (Jia Zhao) и Шэнхуэй Лян (Shenghui Liang) являются лауреатами премии Майкла Смита Health Research BC Trainee Award. Митчелл Дж.С. Браам (Mitchell J.S. Braam) является стипендиатом Mitacs Accelerate Fellowship. Диепирие Г. Иворима является лауреатом стипендии Александра Грэма Белла для выпускников Канады и памятной премии Политехнической школы CFUW 1989 года. Мы искренне благодарим д-ра Эдуарда Г. Стэнли (Edouard G. Stanley) из MCRI и Университета Монаша за совместное использование линии Mel1 INS GFP/W, а также Институт диабета Альберты (Alberta Diabetes Institute Islet Core) за изоляцию и распространение островков человека. Мы также выражаем признательность за поддержку со стороны Института наук о жизни (Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry) при Университете Британской Колумбии. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
