Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters

Bètacellen van de alvleesklier scheiden insuline af als reactie op stijgingen van de bloedglucosespiegel. Patiënten die onvoldoende insulineproductie hebben als gevolg van de auto-immuunvernietiging van bètacellen bij diabetes type 1 (T1D)¹, of als gevolg van bètaceldisfunctie bij diabetes type 2 (T2D)², worden doorgaans behandeld met exogene insuline. Ondanks deze levensreddende therapie kan het niet precies overeenkomen met de voortreffelijke controle van de bloedglucose zoals bereikt door dynamische insulinesecretie van bonafide bètacellen. Als zodanig lijden patiënten vaak aan de gevolgen van levensbedreigende hypoglykemische episodes en andere complicaties als gevolg van chronische hyperglykemische excursies. Transplantatie van menselijke kadavereilandjes herstelt met succes de strakke glykemische controle bij T1D-patiënten, maar wordt beperkt door de beschikbaarheid van eilandjesdonoren en moeilijkheden bij het zuiveren van gezonde eilandjes voor transplantatie ^3,4. Deze uitdaging kan in principe worden opgelost door hPSC’s als alternatief uitgangsmateriaal te gebruiken.

De huidige strategieën voor het in vitro genereren van insuline-afscheidende eilandjes uit hPSC’s zijn vaak gericht op het nabootsen van het proces van embryonale pancreasontwikkeling in vivo ^5,6. Dit vereist kennis van de verantwoordelijke signaalroutes en getimede toevoeging van overeenkomstige oplosbare factoren om kritieke stadia van de zich ontwikkelende embryonale alvleesklier na te bootsen. Het pancreasprogramma begint met de verbintenis tot definitief endoderm, dat wordt gekenmerkt door transcriptiefactoren forkhead box A2 (FOXA2) en geslachtsbepalende regio Y-box 17 (SOX17)⁷. Opeenvolgende differentiatie van definitief endoderm omvat de vorming van een primitieve darmbuis, die uitmondt in een achterste voordarm die de homeobox 1 (PDX1)^7,8,9 van de pancreas en de twaalfvingerige darm tot expressie brengt, en epitheliale expansie in voorlopercellen van de pancreas die PDX1 en NK6 homeobox 1 (NKX6.1)^10,11 tot expressie brengen.

Verdere inzet voor endocriene eilandjescellen gaat gepaard met de voorbijgaande expressie van pro-endocriene hoofdregulator neurogenine-3 (NGN3)12 en stabiele inductie van de belangrijkste transcriptiefactoren neuronale differentiatie 1 (NEUROD1) en NK2 homeobox 2 (^NKX2.2)¹³. De belangrijkste hormoonexpressiecellen, zoals insulineproducerende bètacellen, glucagon-producerende alfacellen, somatostatine-producerende deltacellen en pancreaspolypeptide-producerende PPY-cellen, worden vervolgens geprogrammeerd. Met deze kennis, evenals ontdekkingen uit uitgebreide, high-throughput drug screening studies, hebben recente ontwikkelingen het mogelijk gemaakt om hPSC-eilandjes te genereren met cellen die lijken op bètacellen die in staat zijn tot insulinesecretie 14,15,16,17,18,19.

Stapsgewijze protocollen zijn gerapporteerd voor het genereren van glucose-responsieve bètacellen 6,14,18,19. Voortbouwend op deze studies, omvat het huidige protocol het gebruik van een pancreasvoorloperkit voor het genereren van PDX1+/NKX6.1⁺ pancreasvoorlopercellen in een vlakke cultuur, gevolgd door aggregatie van microtiterplaten in clusters van uniforme grootte en verdere differentiatie in de richting van insuline-afscheidende hPSC-eilandjes met het R-protocol in een statische 3D-suspensiecultuur. Kwaliteitscontroleanalyses, waaronder flowcytometrie, immunokleuring en functionele beoordeling, worden uitgevoerd voor een rigoureuze karakterisering van de differentiërende cellen. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van elke stap van de gerichte differentiatie en schetst de in vitro karakteriseringsbenaderingen.