Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en grupos de islotes productores de insulina
Summary
La diferenciación de las células madre en células de los islotes proporciona una solución alternativa al tratamiento convencional de la diabetes y al modelado de la enfermedad. Describimos un protocolo detallado de cultivo de células madre que combina un kit de diferenciación comercial con un método previamente validado para ayudar a producir islotes derivados de células madre secretores de insulina en una placa.
Abstract
La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) en células beta secretoras de insulina proporciona material para investigar la función de las células beta y el tratamiento de la diabetes. Sin embargo, sigue habiendo desafíos para obtener células beta derivadas de células madre que imiten adecuadamente a las células beta humanas nativas. Sobre la base de estudios previos, se han generado células de islotes derivadas de hPSC para crear un protocolo con mejores resultados de diferenciación y consistencia. El protocolo descrito aquí utiliza un kit de progenitores pancreáticos durante las etapas 1-4, seguido de un protocolo modificado de un artículo publicado previamente en 2014 (denominado “protocolo R” en adelante) durante las etapas 5-7. Se incluyen procedimientos detallados para el uso del kit de progenitores pancreáticos y placas de micropocillos de 400 μm de diámetro para generar grupos de progenitores pancreáticos, el protocolo R para la diferenciación endocrina en un formato de suspensión estática de 96 pocillos, y la caracterización in vitro y la evaluación funcional de los islotes derivados de hPSC. El protocolo completo tarda 1 semana para la expansión inicial de la hPSC, seguida de ~5 semanas para obtener islotes de hPSC productores de insulina. Este protocolo puede ser reproducido por personal con técnicas básicas de cultivo de células madre y formación en ensayos biológicos.
Introduction
Las células beta pancreáticas secretan insulina en respuesta a los aumentos en los niveles de glucosa en sangre. Los pacientes que carecen de suficiente producción de insulina debido a la destrucción autoinmune de las células beta en la diabetes tipo 1 (DT1)1, o debido a la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 (DT2)2, suelen ser tratados con la administración de insulina exógena. A pesar de esta terapia que salva vidas, no puede igualar con precisión el exquisito control de la glucosa en sangre que se logra mediante la secreción dinámica de insulina de las células beta de buena fe. Como tal, los pacientes a menudo sufren las consecuencias de episodios de hipoglucemia potencialmente mortales y otras complicaciones resultantes de excursiones hiperglucémicas crónicas. El trasplante de islotes cadavéricos humanos restaura con éxito un estricto control glucémico en pacientes con diabetes Tipo 1, pero está limitado por la disponibilidad de donantes de islotes y las dificultades para purificar islotes sanos para trasplante 3,4. Este reto puede, en principio, resolverse mediante el uso de hPSC como material de partida alternativo.
Las estrategias actuales para generar islotes secretores de insulina a partir de hPSCs in vitro a menudo apuntan a imitar el proceso de desarrollo embrionario del páncreas in vivo 5,6. Esto requiere el conocimiento de las vías de señalización responsables y la adición programada de los factores solubles correspondientes para imitar las etapas críticas del páncreas embrionario en desarrollo. El programa pancreático se inicia con el compromiso con el endodermo definitivo, que está marcado por los factores de transcripción forkhead box A2 (FOXA2) y la región determinante del sexo Y-box 17 (SOX17)7. La diferenciación sucesiva del endodermo definitivo implica la formación de un tubo intestinal primitivo, que se modela en un intestino anterior posterior que expresa el homeobox 1 pancreático y duodenal (PDX1)7,8,9, y la expansión epitelial en progenitores pancreáticos que coexpresan PDX1 y homeobox 1 NK6 (NKX6.1)10,11.
Un mayor compromiso con las células endocrinas de los islotes se acompaña de la expresión transitoria del regulador maestro proendocrino neurogenina-3 (NGN3)12 y la inducción estable de los factores de transcripción clave diferenciación neuronal 1 (NEUROD1) y NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. Posteriormente, se programan las principales células que expresan hormonas, como las células beta productoras de insulina, las células alfa productoras de glucagón, las células delta productoras de somatostatina y las células PPY productoras de polipéptidos pancreáticos. Con este conocimiento, así como con los descubrimientos de extensos estudios de cribado de fármacos de alto rendimiento, los avances recientes han permitido la generación de islotes hPSC con células parecidas a las células beta capaces de secreción de insulina 14,15,16,17,18,19.
Se han reportado protocolos escalonados para generar células beta sensibles a la glucosa 6,14,18,19. Sobre la base de estos estudios, el presente protocolo implica el uso de un kit de progenitores pancreáticos para generar células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ en un cultivo plano, seguido de la agregación de placas de micropocillos en grupos de tamaño uniforme y una mayor diferenciación hacia islotes de hPSC secretoras de insulina con el protocolo R en un cultivo estático en suspensión 3D. Se realizan análisis de control de calidad, incluida la citometría de flujo, la inmunotinción y la evaluación funcional, para una caracterización rigurosa de las células diferenciadoras. Este artículo proporciona una descripción detallada de cada paso de la diferenciación dirigida y describe los enfoques de caracterización in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se describe un protocolo híbrido de siete etapas que permite la generación de islotes hPSC capaces de secretar insulina tras la exposición a la glucosa dentro de los 40 días posteriores al cultivo in vitro. Entre estos múltiples pasos, se cree que la inducción eficiente del endodermo definitivo establece un punto de partida importante para los resultados finales de diferenciación18,27,28. En el pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo de STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. Jia Zhao y Shenghui Liang han recibido el premio Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam es beneficiario de la beca Mitacs Accelerate. Diepiriye G. Iworima recibió la Beca de Posgrado Alexander Graham Bell Canadá y el Premio Conmemorativo de la Escuela Politécnica 1989 de la CFUW. Agradecemos sinceramente al Dr. Edouard G. Stanley de MCRI y la Universidad de Monash por compartir la línea Mel1 INS GFP/W y al Núcleo de Islotes del Instituto de Diabetes de Alberta por aislar y distribuir islotes humanos. También agradecemos el apoyo de las instalaciones de Imágenes y Citometría de Flujo del Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Columbia Británica. La figura 1 se creó con BioRender.com.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
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