تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين
Summary
يوفر تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا جزرية حلا بديلا لعلاج مرض السكري التقليدي ونمذجة الأمراض. وصفنا بروتوكولا مفصلا لزراعة الخلايا الجذعية يجمع بين مجموعة تمايز تجارية وطريقة تم التحقق من صحتها مسبقا للمساعدة في إنتاج الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية التي تفرز الأنسولين في طبق.
Abstract
يوفر تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى خلايا بيتا التي تفرز الأنسولين مادة للتحقيق في وظيفة خلايا بيتا وعلاج مرض السكري. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات في الحصول على خلايا بيتا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تحاكي بشكل كاف خلايا بيتا البشرية الأصلية. بناء على الدراسات السابقة ، تم إنشاء خلايا جزرية مشتقة من hPSC لإنشاء بروتوكول مع تحسين نتائج التمايز والاتساق. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مجموعة سلفية للبنكرياس خلال المراحل 1-4 ، متبوعا ببروتوكول معدل من ورقة نشرت سابقا في عام 2014 (تسمى “بروتوكول R” فيما بعد) خلال المراحل 5-7. يتم تضمين الإجراءات التفصيلية لاستخدام مجموعة السلف البنكرياسي وألواح microwell بقطر 400 ميكرومتر لتوليد مجموعات السلف البنكرياسي ، وبروتوكول R لتمايز الغدد الصماء في شكل تعليق ثابت 96 بئرا ، والتوصيف في المختبر والتقييم الوظيفي للجزر المشتقة من hPSC. يستغرق البروتوكول الكامل 1 أسبوع لتوسيع hPSC الأولي متبوعا ب ~ 5 أسابيع للحصول على جزر hPSC المنتجة للأنسولين. يمكن للأفراد الذين لديهم تقنيات زراعة الخلايا الجذعية الأساسية والتدريب على المقايسات البيولوجية إعادة إنتاج هذا البروتوكول.
Introduction
تفرز خلايا بيتا البنكرياسية الإنسولين استجابة لارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. عادة ما يتم علاج المرضى الذين يفتقرون إلى إنتاج الأنسولين الكافي بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا في مرض السكري من النوع الأول (T1D) 1 ، أو بسبب خلل خلايا بيتا في مرض السكري من النوع 2 (T2D) 2 ، بإعطاء الأنسولين الخارجي. على الرغم من هذا العلاج المنقذ للحياة ، فإنه لا يمكن أن يتطابق بدقة مع التحكم الرائع في نسبة الجلوكوز في الدم كما يتحقق من خلال إفراز الأنسولين الديناميكي من خلايا بيتا حسنة النية. على هذا النحو ، غالبا ما يعاني المرضى من عواقب نوبات نقص السكر في الدم التي تهدد الحياة والمضاعفات الأخرى الناتجة عن رحلات ارتفاع السكر في الدم المزمنة. ينجح زرع الجزر البشرية في استعادة السيطرة الصارمة على نسبة السكر في الدم لدى مرضى T1D ولكنه محدود بسبب توفر المتبرعين بالجزر والصعوبات في تنقية الجزر الصحية للزرع 3,4. يمكن حل هذا التحدي ، من حيث المبدأ ، باستخدام hPSCs كمواد انطلاق بديلة.
غالبا ما تهدف الاستراتيجيات الحالية لتوليد الجزر التي تفرز الأنسولين من hPSCs في المختبر إلى محاكاة عملية تطور البنكرياس الجنيني في الجسم الحي 5,6. وهذا يتطلب معرفة مسارات الإشارات المسؤولة والإضافة الموقوتة للعوامل القابلة للذوبان المقابلة لمحاكاة المراحل الحرجة من البنكرياس الجنيني النامي. يبدأ برنامج البنكرياس بالالتزام في الأديم الباطن النهائي ، والذي يتميز بعوامل النسخ صندوق شوكة A2 (FOXA2) ومنطقة تحديد الجنس Y-box 17 (SOX17) 7. يتضمن التمايز المتتالي للأديم الباطن النهائي تكوين أنبوب أمعاء بدائي ، ونمط في الأمعاء الأمامية الخلفية التي تعبر عن الصندوق المثلي للبنكرياس والاثني عشر 1 (PDX1) 7،8،9 ، والتوسع الظهاري في أسلاف البنكرياس التي تعبر عن PDX1 و NK6 homeobox 1 (NKX6.1) 10,11.
يرافق المزيد من الالتزام بخلايا جزيرة الغدد الصماء التعبير العابر للمنظم الرئيسي المؤيد للغدد الصماء neurogenin-3 (NGN3) 12 والحث المستقر لعوامل النسخ الرئيسية التمايز العصبي 1 (NEUROD1) و NK2 homeobox 2 (NKX2.2) 13. تتم برمجة الخلايا الرئيسية المعبرة عن الهرمونات ، مثل خلايا بيتا المنتجة للأنسولين ، وخلايا ألفا المنتجة للجلوكاجون ، وخلايا دلتا المنتجة للسوماتوستاتين ، وخلايا PPY المنتجة للببتيد البنكرياس. مع هذه المعرفة ، بالإضافة إلى الاكتشافات من دراسات فحص الأدوية المكثفة وعالية الإنتاجية ، مكنت التطورات الحديثة من توليد جزر hPSC بخلايا تشبه خلايا بيتا قادرة على إفراز الأنسولين14،15،16،17،18،19.
تم الإبلاغ عن بروتوكولات تدريجية لتوليد خلايا بيتا المستجيبة للجلوكوز6،14،18،19. بناء على هذه الدراسات ، يتضمن البروتوكول الحالي استخدام مجموعة سلفية للبنكرياس لتوليد خلايا سلف البنكرياس PDX1 + / NKX6.1 + في ثقافة مستوية ، متبوعة بتجميع صفائح microwell في مجموعات موحدة الحجم والمزيد من التمايز نحو جزر hPSC التي تفرز الأنسولين مع بروتوكول R في ثقافة تعليق 3D ثابتة. يتم إجراء تحليلات مراقبة الجودة ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، والتلطيخ المناعي ، والتقييم الوظيفي ، من أجل التوصيف الدقيق للخلايا المميزة. تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا لكل خطوة من خطوات التمايز الموجه وتحدد مناهج التوصيف في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة بروتوكولا هجينا من سبع مراحل يسمح بتوليد جزر hPSC قادرة على إفراز الأنسولين عند تحدي الجلوكوز في غضون 40 يوما من الثقافة في المختبر. من بين هذه الخطوات المتعددة ، يعتقد أن الحث الفعال للأديم الباطن النهائي يضع نقطة انطلاق مهمة لنتائج التمايز النهائية18،<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر بامتنان الدعم المقدم من STEMCELL Technologies و Michael Smith Health Research BC و Stem Cell Network و JDRF والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. حصل جيا تشاو وشينغهوي ليانغ على جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية في كولومبيا البريطانية للمتدربين. ميتشل ج. س. برام حاصل على زمالة Mitacs Accelerate. حصلت Diepiriye G. Iworima على منحة ألكسندر جراهام بيل الكندية للدراسات العليا وجائزة CFUW 1989 Ecole Polytechnique التذكارية. نشكر بصدق الدكتور إدوارد ج. ستانلي من MCRI وجامعة موناش لمشاركة خط Mel1 INS GFP / W ومعهد ألبرتا للسكري Islet Core لعزل وتوزيع الجزر البشرية. كما نعترف بالدعم المقدم من مرافق التصوير وقياس التدفق الخلوي التابعة لمعهد علوم الحياة في جامعة كولومبيا البريطانية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
