התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין
Summary
התמיינות תאי גזע לתאי איון מספקת פתרון חלופי לטיפול קונבנציונלי בסוכרת ולמידול מחלות. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של תרבית תאי גזע המשלב ערכת התמיינות מסחרית עם שיטה שאושרה בעבר כדי לסייע בייצור איים מפרישי אינסולין שמקורם בתאי גזע בצלחת.
Abstract
התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) לתאי בטא מפרישי אינסולין מספקת חומר לחקר תפקוד תאי בטא וטיפול בסוכרת. עם זאת, נותרו אתגרים בהשגת תאי בטא שמקורם בתאי גזע המחקים כראוי תאי בטא אנושיים מקומיים. בהתבסס על מחקרים קודמים, תאי איון שמקורם ב-hPSC נוצרו כדי ליצור פרוטוקול עם תוצאות התמיינות ועקביות משופרות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בערכת אב לבלב בשלבים 1-4, ואחריה פרוטוקול שונה ממאמר שפורסם בעבר בשנת 2014 (להלן “פרוטוקול R”) במהלך שלבים 5-7. נהלים מפורטים לשימוש בערכת אב הלבלב ולוחות מיקרווול בקוטר 400 מיקרומטר ליצירת אשכולות אב לבלב, פרוטוקול R להתמיינות אנדוקרינית בפורמט תרחיף סטטי של 96 בארות, ואפיון חוץ גופי והערכה תפקודית של איים שמקורם ב- hPSC, כלולים. הפרוטוקול המלא לוקח שבוע אחד להרחבה ראשונית של hPSC ואחריו ~ 5 שבועות להשגת איים hPSC מייצרי אינסולין. אנשי צוות עם טכניקות בסיסיות של תרבית תאי גזע והכשרה בבדיקות ביולוגיות יכולים לשחזר פרוטוקול זה.
Introduction
תאי בטא בלבלב מפרישים אינסולין המגיב לעלייה ברמות הגלוקוז בדם. חולים ללא ייצור אינסולין מספיק עקב הרס אוטואימוני של תאי בטא בסוכרת מסוג 1 (T1D)1, או עקב תפקוד לקוי של תאי בטא בסוכרת מסוג 2 (T2D)2, מטופלים בדרך כלל במתן אינסולין אקסוגני. למרות טיפול מציל חיים זה, הוא אינו יכול להתאים במדויק לשליטה המעודנת ברמת הגלוקוז בדם כפי שהיא מושגת על ידי הפרשת אינסולין דינמית מתאי בטא בתום לב. ככאלה, חולים סובלים לעתים קרובות מההשלכות של אירועי היפוגליקמיה מסכני חיים וסיבוכים אחרים הנובעים מטיולים היפרגליקמיים כרוניים. השתלת איים גוותיים אנושיים משחזרת בהצלחה שליטה גליקמית הדוקה בחולי סוכרת סוג 1, אך מוגבלת על ידי זמינותם של תורמי איים וקשיים בטיהור איים בריאים להשתלה 3,4. אתגר זה יכול, באופן עקרוני, להיפתר על ידי שימוש ב-hPSCs כחומר מוצא חלופי.
האסטרטגיות הנוכחיות ליצירת איים מפרישי אינסולין מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) במבחנה שואפות לעתים קרובות לחקות את תהליך התפתחות הלבלב העוברי in vivo 5,6. זה דורש ידע של מסלולי איתות אחראי והוספה מתוזמנת של גורמים מסיסים מתאימים כדי לחקות שלבים קריטיים של הלבלב העוברי המתפתח. תוכנית הלבלב מתחילה עם המחויבות לאנדודרם סופי, המסומן על ידי גורמי שעתוק תיבת מזלג A2 (FOXA2) ואזור קביעת מין Y-box 17 (SOX17)7. התמיינות רצופה של אנדודרם סופי כרוכה בהיווצרות של צינור מעיים פרימיטיבי, היוצר תבנית למעי קדמי אחורי המבטא את ההומיאובוקס 1 של הלבלב והתריסריון 1 (PDX1)7,8,9, והתרחבות אפיתל לאבות לבלב המבטאים יחד PDX1 ו- NK6 הומיאובוקס 1 (NKX6.1)10,11.
מחויבות נוספת לתאי איון אנדוקריני מלווה בביטוי ארעי של רגולטור ראשי פרו-אנדוקריני נוירוגנין-3 (NGN3)12 ואינדוקציה יציבה של גורמי שעתוק מרכזיים התמיינות עצבית 1 (NEUROD1) ו- NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. התאים העיקריים המבטאים הורמונים, כגון תאי בטא מייצרי אינסולין, תאי אלפא מייצרי גלוקגון, תאי דלתא מייצרי סומטוסטטין ותאי PPY מייצרי פוליפפטיד בלבלב, מתוכנתים לאחר מכן. עם הידע הזה, כמו גם תגליות ממחקרי סינון תרופות נרחבים ובעלי תפוקה גבוהה, ההתקדמות האחרונה אפשרה יצירת תאי hPSC עם תאים הדומים לתאי בטא המסוגלים להפריש אינסולין 14,15,16,17,18,19.
פרוטוקולים הדרגתיים דווחו לייצור תאי בטא מגיבים לגלוקוז 6,14,18,19. הפרוטוקול הנוכחי, המבוסס על מחקרים אלה, כולל שימוש בערכת אב לבלב ליצירת תאי אב לבלב PDX1+/NKX6.1+ בתרבית מישורית, ולאחר מכן צבירת לוחות מיקרווול לצבירים בגודל אחיד והתמיינות נוספת לעבר איי hPSC מפרישי אינסולין עם פרוטוקול R בתרבית תרחיף תלת-ממדית סטטית. ניתוחי בקרת איכות, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוסטיין והערכה תפקודית, מבוצעים לאפיון קפדני של התאים המתמיינים. מאמר זה מספק תיאור מפורט של כל שלב של הבידול המכוון ומתאר את גישות האפיון במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול היברידי בן שבעה שלבים המאפשר יצירת איים hPSC המסוגלים להפריש אינסולין על אתגר גלוקוז תוך 40 יום מהתרבית במבחנה. בין השלבים המרובים הללו, אינדוקציה יעילה של אנדודרם סופי נחשבת כנקודת התחלה חשובה לתוצאות הבידול הסופיות18,27,28<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בהכרת תודה על התמיכה של STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות. ג’יה ג’או ושנגהווי ליאנג הם מקבלי פרס מייקל סמית ‘מחקר בריאות BC Trainee Award. מיטשל ג’.ס. בראם זכה במלגת Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima הוא חתן מלגת אלכסנדר גרהם בל קנדה בוגר ואת CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. אנו מודים מקרב לב לד”ר אדואר ג. סטנלי מ-MCRI ומאוניברסיטת מונאש על שיתוף קו Mel1 INS GFP/W ועל ליבת Islet Core של מכון אלברטה לסוכרת על בידוד והפצה של איים אנושיים. אנו מודים גם על התמיכה ממתקני הדמיה וציטומטריית זרימה של המכון למדעי החיים באוניברסיטת קולומביה הבריטית. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
