Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones

Las lesiones cerebrales traumáticas (TBI, por sus siglas en inglés), que pueden ser el resultado de lesiones deportivas, colisiones de vehículos y combates militares, son un problema de salud mundial. El TCE puede provocar déficits fisiológicos, cognitivos y conductuales, y discapacidad o mortalidad de por vida ^1,2. La gravedad del TCE se puede clasificar en leve, moderada y grave, siendo la gran mayoría un TCE leve (75-90%)³. Cada vez se reconoce más que el TCE, en particular la ocurrencia repetitiva de TCE, puede promover la degeneración neuronal y servir como factores de riesgo para varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (DFT) y la encefalopatía traumática crónica (ETC)^4,5,6. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la neurodegeneración inducida por LCT siguen sin estar claros y, por lo tanto, representan un área activa de estudio. Para obtener información sobre cómo las neuronas responden y se recuperan de un TCE, se describe aquí un método para monitorear proteínas de interés marcadas con fluorescencia, específicamente dentro de las neuronas, mediante imágenes intravitales longitudinales en ratones después de un TCE.

Con este fin, este estudio muestra cómo combinar un procedimiento quirúrgico para la administración de TCE de cráneo cerrado que es similar al descrito previamente^7,8, junto con un procedimiento quirúrgico para la implantación de una ventana craneal para la imagen intravital posterior^, según lo descrito por Goldey et al⁹. En particular, no es factible implantar primero una ventana craneal y posteriormente realizar un TCE en la misma región, ya que es probable que el impacto de la caída de peso que induce el TCE dañe la ventana y cause daños irreparables al ratón. Por lo tanto, este protocolo fue diseñado para administrar el TCE y luego implantar la ventana craneal directamente sobre el sitio del impacto, todo dentro de la misma sesión quirúrgica. Una ventaja de combinar el TCE y el implante de la ventana craneal en una sola sesión quirúrgica es la reducción del número de veces que un ratón se somete a cirugía. Además, permite monitorear la respuesta inmediata (es decir, en la escala de tiempo de horas) a la LCT, en lugar de implantar la ventana en una sesión quirúrgica posterior (es decir, las imágenes iniciales comienzan en una escala de tiempo de días después de la LCT). La ventana craneal y la plataforma de imagen intravital también ofrecen ventajas sobre la monitorización de proteínas neuronales mediante métodos convencionales como la inmunotinción de tejidos fijos. Por ejemplo, se requieren menos ratones para la obtención de imágenes intravitales, ya que el mismo ratón se puede estudiar en múltiples puntos de tiempo, a diferencia de las cohortes separadas de ratones necesarias para puntos de tiempo discretos. Además, las mismas neuronas pueden ser monitoreadas a lo largo del tiempo, lo que permite rastrear eventos biológicos o patológicos específicos dentro de la misma célula.

Como prueba de concepto, aquí se demuestra la expresión neuronal específica de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) bajo el promotor de sinapsina¹⁰. Este enfoque puede extenderse a 1) diferentes tipos de células cerebrales mediante la utilización de otros promotores específicos del tipo de célula, como el promotor de la proteína básica de mielina (MBP) para los oligodendrocitos y el promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para los astrocitos¹¹, 2) diferentes proteínas diana de interés mediante la fusión de sus genes con el gen EGFP, y 3) la coexpresión de múltiples proteínas fusionadas con diferentes fluoróforos. Aquí, el EGFP se empaqueta y se expresa a través de la administración de virus adenoasociados (AAV) a través de una inyección intracraneal. Se administra un traumatismo craneoencefálico cerrado mediante un dispositivo de caída de peso, seguido de la implantación de una ventana craneal. La visualización del EGFP neuronal se logra a través de la ventana craneal, utilizando microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia del EGFP in vivo. Con el láser de dos fotones, es posible penetrar más profundamente en el tejido cortical con un mínimo de fotodaño, lo que permite obtener imágenes longitudinales repetidas de las mismas regiones corticales dentro de un ratón individual durante días y hasta meses^12,13,14,15. En resumen, este enfoque de combinar una cirugía de TCE con imágenes intravitales tiene como objetivo avanzar en la comprensión de los eventos moleculares que contribuyen a la patología de la enfermedad inducida por LCT^16,17.