Imagerie intravitale de l’expression de protéines fluorescentes chez des souris présentant un traumatisme crânien à crâne fermé et une fenêtre crânienne à l’aide d’un microscope à deux photons

Les traumatismes crâniens (TCC), qui peuvent résulter de blessures sportives, de collisions de véhicules et de combats militaires, sont un problème de santé mondial. Les traumatismes crâniens peuvent entraîner des déficits physiologiques, cognitifs et comportementaux, ainsi qu’une invalidité ou une mortalité à vie ^1,2. La gravité des traumatismes crâniens peut être classée comme légère, modérée et sévère, la grande majorité étant un traumatisme crânien léger (75 % à 90 %)³. Il est de plus en plus reconnu que les traumatismes crâniens, en particulier les occurrences répétitives de traumatismes crâniens, peuvent favoriser la dégénérescence neuronale et servir de facteurs de risque pour plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (DFT) et l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC)^4,5,6. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la neurodégénérescence induite par les TCC restent flous et représentent donc un domaine d’étude actif. Pour mieux comprendre comment les neurones réagissent et se rétablissent d’un traumatisme crânien, une méthode de surveillance des protéines d’intérêt marquées par fluorescence, en particulier dans les neurones, par imagerie intravitale longitudinale chez la souris après un traumatisme crânien est décrite ici.

À cette fin, cette étude montre comment combiner une intervention chirurgicale pour l’administration d’un traumatisme crânien fermé qui est similaire à ce qui a été rapporté précédemment^7,8, avec une procédure chirurgicale pour l’implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale en aval^, telle que décrite par Goldey et al⁹. Notamment, il n’est pas possible d’implanter d’abord une fenêtre crânienne et d’effectuer ensuite un TCC dans la même région, car l’impact de la perte de poids qui induit le TCC est susceptible d’endommager la fenêtre et de causer des dommages irréparables à la souris. Par conséquent, ce protocole a été conçu pour administrer le traumatisme crânien, puis implanter la fenêtre crânienne directement sur le site d’impact, le tout au cours de la même séance chirurgicale. L’un des avantages de combiner à la fois le traumatisme crânien et l’implantation de la fenêtre crânienne en une seule séance chirurgicale est la réduction du nombre de fois qu’une souris est soumise à une intervention chirurgicale. De plus, il permet de surveiller la réponse immédiate (c’est-à-dire sur une échelle de temps de quelques heures) à un traumatisme crânien, par opposition à l’implantation de la fenêtre lors d’une séance chirurgicale ultérieure (c’est-à-dire l’imagerie initiale commençant sur une échelle de temps de plusieurs jours après le traumatisme crânien). La fenêtre crânienne et la plateforme d’imagerie intravitale offrent également des avantages par rapport à la surveillance des protéines neuronales par des méthodes conventionnelles telles que l’immunomarquage des tissus fixés. Par exemple, moins de souris sont nécessaires pour l’imagerie intravitale, car la même souris peut être étudiée à plusieurs moments, par opposition à des cohortes distinctes de souris nécessaires pour des points temporels discrets. De plus, les mêmes neurones peuvent être surveillés au fil du temps, ce qui permet de suivre des événements biologiques ou pathologiques spécifiques au sein de la même cellule.

À titre de preuve de concept, l’expression neuronale spécifique de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous le promoteur de synapsine est démontrée ici¹⁰. Cette approche peut être étendue à 1) différents types de cellules cérébrales en utilisant d’autres promoteurs spécifiques au type cellulaire, tels que le promoteur de la protéine de base de la myéline (MBP) pour les oligodendrocytes et le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour les astrocytes,¹¹, 2) différentes protéines cibles d’intérêt en fusionnant leurs gènes avec le gène EGFP, et 3) co-exprimant plusieurs protéines fusionnées à différents fluorophores. Ici, l’EGFP est conditionné et exprimé par l’administration d’un virus adéno-associé (AAV) par injection intracrânienne. Un traumatisme crânien fermé est administré à l’aide d’un dispositif de perte de poids, suivi de l’implantation d’une fenêtre crânienne. La visualisation de l’EGFP neuronal est réalisée à travers la fenêtre crânienne, en utilisant la microscopie à deux photons pour détecter la fluorescence de l’EGFP in vivo. Avec le laser à deux photons, il est possible de pénétrer plus profondément dans le tissu cortical avec un minimum de photodommages, ce qui permet une imagerie longitudinale répétée des mêmes régions corticales au sein d’une souris individuelle pendant des jours et jusqu’aux mois^12,13,14,15. En somme, cette approche combinant une chirurgie de traumatisme crânien avec l’imagerie intravitale vise à faire progresser la compréhension des événements moléculaires qui contribuent à la pathologie de la maladie induite par le TCC^16,17.